小型猪冠脉模型研究中，药代动力学评价是对新型药物洗脱支架的评价非常重要的一项指标。其中包括体外药代动力学检测以及组织药物浓度监测。以西罗莫司洗脱支架小型猪冠脉模型实验为例向大家进行系统介绍。

1．试剂

(1)西罗莫司标准品，批号：070101，分子量：914.2Da。

(2)DMORPM(内标)标准品，分子量：884.2Da。

(3)醇：Burdick&Jackson，HPLC级，批号：G90G1H。

(4)乙酸：北京化学试剂公司，分析纯，批号：20060512。

(5)乙酸乙酯：北京化学试剂公司，分析纯，批号：060119。

(6)乙酸铵：北京益利精细化学品有限公司，分析纯，批号：20010323。

(7)水乙酸钠：北京益利精细化学品有限公司，分析纯，批号：951022。

(8)水：Milli Q纯化系统制备的去离子水。

(9)乙腈(色谱级)：美国霍尼韦尔公司。

(10)四氢呋喃(色谱级)：美国霍尼韦尔公司。

2．主要设备

(1)HPLC-MS/MS系统由2690型高效液相色谱(Waters公司)及电喷雾离子源的 API-3000型三重串联四极杆质谱仪(美国应用生物技术公司)组成。

(2)Milli Q纯水机(大迈仪器(上海)有限公司)。

(3)低温高速离心机(德国Heraeus公司)。

(4)Coming 320 pH计(美国康宁公司)。

(5)Mettler AX105型分析天平(瑞士梅特勒-托尔多公司)。

3．分析条件  HPLC条件：选用Alltech公司Alltima C18 2.1mm×50mm(3μm)色谱柱；柱温为51℃；流动相由80％甲醇和20％10mmol/L乙酸铵(pH=5.1)组成；流速0.2ml/min每一个样品分析用时5分钟。串联质谱条件：采用电喷雾离子源(electrospray ionization， ESI)，在正离子电离模式下，选用多反应监测(multiple reaction monitoring，MRM)的质谱扫描方式进行测定，西罗莫司和内标的母、子离子对的质荷比分别为：931.7(M+NH4+)→864.7和901.8(M+NH4+)→834.8。

4．体外药代动力学分析过程

(1)对照品溶液的配置：精密称取西罗莫司对照品适量，用乙腈-水(65：35)稀释成每

1ml中含20μg的溶液即得。

(2)供试品溶液的制备：将无聚合物载体西罗莫司洗脱支架和聚合物载体西罗莫司洗脱支架各6枚分别浸入5ml、7％牛血清白蛋白中，恒温37℃，以80r/min进行震荡。分别于2小时，1天，7天，14天，各取出支架，放入离心管中。精密加5ml甲醇，静置4小时，密闭超声5分钟，取10μl或20μl为供试品溶液。

(3)色谱条件与系统适用性：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇-乙腈-水(63：14：13)为流动相；检测波长280nm，流速1ml/min，柱温为40℃。以对照品溶液作为系统适用性试验溶液，精密量取20μl注入液相色谱仪，洗脱顺序为：西罗莫司B异构体和西罗莫司C异构体。西罗莫司B异构体的保留时间应在15～22分钟，理论塔板数按西罗莫司B异构体峰计算应不低于2000，西罗莫司B，C异构体分离度不得小于1.2。

(4)测定：按高效液相色谱法HPLC(2000版中国药典二部附录VD)分别进样供试品溶液和对照品溶液，记录峰面积。按外标法以西罗莫司8、C异构体峰面积之和计算供试品中药物含量。

5．体内冠脉组织摄取西罗莫司含量测定

(1)西罗莫司贮备液的配制

1)西罗莫司标准曲线贮备液(1mg/ml)的配制：精密称取西罗莫司标准品10.13mg，转移至10ml容量瓶中，加入适量甲醇溶解后以甲醇定容至刻度，得到1mg/ml贮备液(即母液)，贮存于-30℃冰箱备用。准确吸取0.1ml上述贮备液，转移至10ml容量瓶中，以纯水定容至刻度，得10μg/ml标准曲线工作液，贮存于-30℃冰箱备用。

2)西罗莫司质控贮备液(1mg/ml)的配制：精密称取西罗莫司标准品10.12mg，转移至10ml容量瓶中，加入适量甲醇溶解后以甲醇定容至刻度，得到1mg/ml贮备液，贮存于-30℃冰箱备用。准确吸取0.1ml上述贮备液，转移至10ml容量瓶中，以甲醇定容至刻度，得10μg/ml质控工作液，贮存于-30℃冰箱备用。准确吸取1ml上述10μg/ml质控工作液，转移至100ml容量瓶中，以空白动脉匀浆(动脉重量：水体积=1：4g/ml)定容至刻度，得100ng/ml质控工作液，贮存于-30℃冰箱备用。

(2)内标贮备液的配制：精密称取内标标准品5.05mg，转移至10ml容量瓶中，加入适量甲醇溶解并定容至刻度，得到500μg/ml贮备液，贮存于-30℃冰箱备用。准确吸取0.2ml上述母液，转移至10ml容量瓶中，以甲醇定容至刻度，得10μg/ml内标工作液，贮存于-30℃冰箱备用。准确吸取1ml上述10μg/ml内标工作液，转移至100ml容量瓶中，以甲醇定容至刻度，得100ng/ml内标工作液，贮存于4℃冰箱备用。

(3)动脉匀浆标准曲线和质控样品的配制：选取10只健康小型猪，建立静脉通路后，放血处死，立即打开胸腔，取出心脏，仔细分离挂冠脉组织。将组织精确称重后，放入微量组织匀浆器中(10000r/min)制成组织匀浆，-30℃冰箱保存。

以猪空白动脉匀浆为溶剂，按照下表配制浓度分别为0.2、0.5、2、5、10、20、50和100ng/ml的标准曲线样品，以及低、中、高3个浓度的质控样品(低浓度为0.5ng/ml；中浓度为20ng/ml；高浓度为80ng/ml)。将上述样品分装，贮存于-30℃冰箱备用。

准确量取8ml空白猪动脉匀浆(动脉重量：水体积=1：4g/ml)，转移至100ml容量瓶中，以纯水定容至刻度，混匀，贮存于-30℃冰箱备用。准确量取8ml空白猪动脉匀浆，转移至100ml容量瓶中，以纯水定容至刻度，混匀，贮存于-30℃冰箱备用。

将动脉匀浆样品于室温下解冻，混匀10秒后，取500μl动脉匀浆样品，加入100μl内标工作液(100ng/ml)，混匀30秒。加入0.1mol/L乙酸钠2ml，混匀30秒。加入4ml乙酸乙酯，混匀40秒，振摇10分钟。于3850r/min，4℃条件下离心10分钟后，将上层有机相转移至玻璃试管中，于40℃、N2气流下吹干。加入200μl复溶液(甲醇：10mM乙酸铵=2：1，v：v)混匀1分钟后微量滤器(0.22μm)过滤。在3.6中所述的HPLC-MS/MS条件下进行测定，记录质量色谱图及化合物的峰面积，采用内标法进行定量。

(4)考核内容及方法

1)特异性：用于特异性考核的样品包括：空白猪动脉匀浆样品(double blank)、空白动脉匀浆加入内标工作液(blank)、质控样品和未知浓度的猪动脉匀浆样品。按照上述方法处理并获得的质量色谱图中根据保留时间来判断有无干扰峰。评价标准：干扰峰的峰面积应小于最低定量限峰面积的20％。

2)标准曲线：按照上述方法处理并测定标准曲线样品。以西罗莫司与内标的峰面积之比为Y，浓度为X，进行直线拟合(权重系数1/x2)。标准曲线的曲线回归方程为Y=aX+b。评价标准：相关系数r≥0.99；最低定量浓度样品的精密度(RSD％)应在20％以内，准确度(RE％)应在±20％以内；其他标准曲线样品的精密度(RSD％)应在15％以内，准确度(RE％)应在±15％以内。

3)精密度和准确度：从低至高3种不同浓度的质控样品：LQC(低浓度质控样品)、 MQC(中浓度质控样品)和HQC(高浓度质控样品)，按照3.6和3.9所述方法处理并测定5个，连续3批，计算日内和日间精密度(RSD％)和准确度(RE％)。评价标准：精密度(RSD％)应在15％以内，准确度(RE％)应在±15％以内。