摘要：在体内涉及探索细胞功能，发育机制和其他重要过程时，生物成像是一项繁琐的任务。由于样本大小，完整和不透明组织的散射，未处理动物的色素沉着，活体器官的移动以及在生理条件下保持样本等不同的问题，单细胞分辨率具有挑战性。这些因素可能导致研究人员采用合适的动物模型来实施显微镜技术，以模拟活细胞的性质。斑马鱼因其在高级显微技术下的透明性而在生物医学研究领域享有盛誉。因此，各种显微镜技术，包括多光子显微技术、激光片层扫描显微技术和二次谐波显微成像技术，简化了斑马鱼不同类型内部功能的发现。在这篇综述中，我们简要讨论了三种最新的显微镜技术，因为它们在研究斑马鱼胚胎和幼虫的发育过程中是非侵入性的。

简介：对活生物体进行成像不容易，因为将合适的动物模型与适当的显微镜技术相匹配具有挑战性。在这种情况下，不同的动物模型上采用不同的先进显微方法来探究疾病的病因或探寻发现新药的可行性。然而，其中一些技术受到严重限制。斑马鱼最有利的特征是它的透明性，对光学成像的适应性，以及易于产生转基因品系的能力。这些特征使斑马鱼成为解决脊椎动物体内研究问题的出色动物模型。先进的显微镜技术实现了此目的的应用，如荧光相关光谱（FCS）、多光子显微技术（MPM）激光片层扫描显微技术（LSM）。阐明和理解病理生理事件是揭示体内解剖和病理生理变化的重要步骤。

我们简要讨论了斑马鱼在三种先进显微镜技术中的作用：双光子显微技术（TPM）、二次谐波显微成像技术（SHG）和激光片层扫描显微技术（LSM）。选择这些技术的原因各不相同，包括非侵入性，对完整生物样品进行深层穿透力的高分辨率成像以及对活斑马鱼胚胎和幼虫的不影响其生存力或行为的成像。

斑马鱼和显微技术：

斑马鱼的透明性是一个主要特征；因此，许多最近的研究利用先进的显微技术对斑马鱼进行了研究，以探索与脊椎动物发育、功能基因组学、器官功能、行为、毒理学和药物发现有关的重大事件。通过用非天然糖处理斑马鱼，在细胞表面标记含氮化物的聚糖，将活的斑马鱼胚胎用于聚糖成像。在发育过程中，不同器官新聚糖生物合成显著增加。多色检测有助于进行聚糖运输和表达的时空研究，这是常规显微技术无法实现的。斑马鱼的凋亡胚胎细胞可以在体内观察到，科学家们通过基因编码的荧光报告蛋白成功标记了凋亡细胞。作为一种特殊的动物模型，能在单细胞分辨率下描述了细胞凋亡和神经元死亡。后来，通过荧光寿命成像（FLIM）和光学投影层析成像（OPT）组合研究了活斑马鱼幼虫的凋亡。FLIM OPT率先使用遗传表达的Förster共振能量转移（FRET）生物传感器监测体内随时间进行的细胞凋亡。赵和同事利用高空间分辨率的斑马鱼活体胚胎探针，通过多重成像（FRET）验证了一种功能成像方法。他们表示有可能通过表达双FRET传感器以低分辨率测量Ca2 +和cAMP的水平。FRET快速，稳定并且与体内功能显微镜的各种传感器兼容。 因此，有人提出FRET将促进整个活生物体中复杂细胞系统的成像。最近合成了一种新型的双光子荧光探针（RN3），可通过FRET检测斑马鱼幼虫中的Pd2 +，由于RN3具有出色的生物相容性和低细胞毒性，因此在监测Pd2 +方面具有显著优势。

双光子显微技术观察斑马鱼：

新的透明斑马鱼胚胎高分辨率无创成像技术使科学家能够可视化斑马鱼早期发育期间的形态发生，并了解整个动物模型中的细胞膜及其组织结构。许多荧光脂质类似物和探针已在斑马鱼中得到有效应用。例如，新的非线性光学技术，包括无标记的脂质可视化，为使用斑马鱼进行脂质研究提供了新的机遇。2010年首次报道了一个完整生物体内脂质顺序的膜图像。

用Laurdan染料多光子成像斑马鱼幼虫膜序相的原理示意图。

根据Renninger和Orger 2013的报告，斑马鱼体内的钙成像包括双光子显微技术。基因编码的钙指示剂已成功解锁了记录斑马鱼神经种群活动的限制条件。两光子显微技术能够以单细胞分辨率成像全脑，并在斑马鱼中生成有趣的全脑功能图。通过对斑马鱼使用双光子显微技术，用Laurdan染色法观察了极化上皮细胞的微结构域，量化了不同发育阶段（受精后3-11dpf）的肠、肾和肝导管上皮细胞的膜顺序。结果发现，上述三种组织的极化上皮细胞在发育过程中膜序发生了显著变化，在6dpf期获得了较高的膜序。本研究强调了 细胞膜脂肪微区域在斑马鱼发育早期的细胞功能和器官发生中的关键作用。

双光子显微技术结合Laurdan染料对3dpf到11dpf的不同发育阶段斑马鱼组织（肠道、肾脏和肝脏）进行图像采集。

双光子显微技术的缺点：

尽管双光子显微技术有许多优点，但这种技术也有一些缺点。例如，在发生光化学相互作用的焦距处，光漂白和光损伤是最常见的伪影。由于样品上的高曝光量，可能会产生不利的热量。 这可能会导致样品的直接损伤和相当大的形态变化，尤其是在有色组织中。但是可以将样品暴露于较短的激光脉冲中来减少这种损坏。

二次谐波显微成像技术观察斑马鱼：

高次谐波产生技术，包括二次和三次谐波产生，是在斑马鱼中使用的非侵入性成像技术，具有精确的穿透力，毫米和亚微米的三维分辨率。

斑马鱼胚胎二次谐波和三次谐波成像示意图

在这项技术中，无需任何预处理即可成功检测出厚度小于1毫米斑的马鱼胚胎的复杂体内发育过程。即使在高光照和长期观察的情况下，也没有发现明显的损伤，在幼虫期之前也没有发现对胚胎的不利影响。三维分辨率使研究人员能够获得胚胎和幼虫体内细胞过程的图像。这项有效的技术可一窥胚胎发生过程中细胞学结构动态，为发育生物学的研究增加了有价值的发现。例如，在没有任何标记的情况下通过SHG和THG成功对斑马鱼胚胎卵裂期的细胞行为进行了三维（3D）成像。

使用THG和SHG以及2PEF对未标记斑马鱼胚胎卵裂期进行to to显像的成功图像

二次谐波显微成像技术用于研究斑马鱼鳍伤口愈合过程中的胶原组织。结果表明胶原纤维在鱼鳍再生长过程中的重要性。该技术可对胶原纤维在发育，伤口愈合，巨噬细胞反应以及巨噬细胞和胶原纤维之间的潜在相互作用进行无创评估。通过SHG成像为活体动物伤口愈合过程中的组织再生提供了新的认识。

二次谐波显微成像技术缺点：

尽管SHG显微术在生物组织成像方面有一定的效果，但仍存在一定的局限性。其中一个限制是穿透深度。因此，这可能使SHG显微技术不适合某些生物学应用，主要是当感兴趣的区域深深地位于组织或器官内部时；因此，SHG无法探及。SHG显微技术最大的问题是它只能成像一些结构蛋白或有害分子，如Ⅰ型和Ⅲ型胶原、肌动球蛋白复合物、胆固醇晶体、中心体和有丝分裂纺锤体。不幸的是，迄今为止，科学家们找不到能够区分纤维状胶原蛋白类型的方法。然而，这些限制可以通过找到合适的成像解决方案来控制。

激光片层扫描显微技术

通过利用斑马鱼的光学特征，激光片层扫描显微技术（LSM）成为胚胎发育成像的首选技术。LSM具有光学切片深、帧频高、激发强度弱、光毒性小、安装技术适中、成像速度快、信噪比高、不同角度成像时间长等优点。建立了数字激光扫描荧光显微技术，以报告野生型和突变型斑马鱼胚胎的核运动和定位。他们能够基于形态动力学对称性来测量胚胎的身体轴。 他们还创建了一个胚层模型，该模型表明中胚层发育在细胞分裂的特定阶段中形成了约33％的胚胎细胞。

通过直角照明和检测对斑马鱼幼虫进行成像。

应用基因编码钙指示剂GCaMP5G联合激光片层扫描显微技术对斑马鱼幼鱼脑内80%以上的神经元进行了活体成像研究。在一项研究中，成功识别了具有相关活动模式的两个神经元群体。此外，光片荧光显微镜（LSFM）在研究斑马鱼的眼睛形态发生方面非常有效，强调为此目的，LSFM可能比常规共聚焦成像更好。由于共焦显微镜和双光子显微镜在光学范围和扫描速度上的局限性，对斑马鱼胚胎大脑进行全方位成像是一项挑战。光片荧光显微镜（LSFM）是对活的转基因斑马鱼胚胎的整个头部进行成像的有效方法

LSM获取的斑马鱼胚胎视网膜发育的不同阶段从1.5dpf到3.5dpf*。

激光片层扫描显微技术缺点：

尽管LSFM是唯一一种允许在不使样品暴露于焦平面外的光的情况下进行体积成像的技术。，但是LSFM经常需要在实验设计中进行修改，并且存在照明问题。当需要在LSFM成像期间实现高速采集时，，用于产生扫描光片的逐行照明需要高峰值功率。高峰值功率会使生物体内固有的活性氧清除机制受到影响，从而引起生物样品的光损伤。激光片层扫描显微技术需要大量的内存存储，这要求用户拥有数据存储渠道。需要额外的光学器件来产生光片，这可能会给成像系统和样品安装带来空间限制，这可以通过在照明体系结构中进行修改来解决。

结论：双光子显微技术是研究斑马鱼不同主题的一种很有前途的方法。当采用适当的激光强度时，焦点内的光漂白是双光子显微技术的主要弱点，图像采集过程中几乎不存在对斑马鱼器官的光损伤。双光子显微技术在斑马鱼胚胎成像中也显示出良好的性能，因此被认为是解决系统生物学和胚胎发育当前研究问题的有力工具。

二次谐波显微成像技术（SHG）具有许多优点。它适用于对完整的活体组织进行无标记成像。此外，它的近红外激发是非线性的，使得光学切片具有最小的自荧光背景和最小的生物样品光化学损伤。SHG不涉及吸收，因为它是一个非共振过程。通过增加激发光的重复频率，可以固定谐波产生弱信号强度的限制。SHG成像是研究斑马鱼早期发育过程中体内结构蛋白（主要是胶原蛋白和肌肉肌节）的一种有前途的工具。当它与基因编码的荧光标记一起使用时，在斑马鱼中变得更加有效。SHG和THG结合有一个潜在的优势，，因为除了记录和成像斑马鱼胚胎发育阶段的细胞性能外，这还可以确定斑马鱼胚胎神经系统中的基因表达水平。

激光片层扫描显微技术（LSFM）可以对活体样品进行快速成像，高信噪比，最小的光致漂白和毒性以及三维成像。这些功能使科学家能够量化整个胚胎在整个发育过程中的细胞动力学。LSFM具有先进的功能，例如4D活体成像，可以在发育过程中揭示组织中的体积细胞结构。LSFM已与结构照明（SI）结合使用，以消除散射光和离焦光。 这种强大的组合在垂直和轴向方向上增强了在斑马鱼幼虫阶段神经活动成像过程中的分辨率和对比度。

总之，这三种先进的显微镜技术在进行体内研究时各有利弊。将来，我们建议通过结合两种不同的方式进行更进一步的改进，以解决更有效的可视化问题。以斑马鱼为动物模型的高分辨率非线性光学显微技术消除许多挑战，在病理学过程中这些挑战限制了组织结构变化的检测。

原文出自：https://link.springer.com/article/10.1186/s42826-020-00044-2