SARS-CoV-2在表达人血管紧张素转化酶2的转基因小鼠中的发病机理

COVID-19自2019年起在全球范围内传播，目前已对公共卫生构成严重威胁。我们先前将病原鉴定为一种新型的SARS相关冠状病毒（SARS-CoV-2），它使用人血管紧张素转化酶2（hACE2）作为进入受体。在这里，我们成功开发了SARS-CoV-2 hACE2转基因小鼠（C3B6小鼠中的HFH4-hACE2）感染模型。感染的小鼠产生典型的间质性肺炎和病理，与COVID-19患者相似。病毒定量显示肺是感染的主要部位，尽管在某些小鼠的眼睛，心脏和大脑中也可以发现病毒RNA。从感染的肺和脑组织中分离出全基因组序列与SARS-CoV-2相同的病毒。最后，我们发现预先暴露于SARS-CoV-2可以保护小鼠免受严重肺炎的影响。我们的结果表明，hACE2小鼠将成为测试潜在疫苗和治疗剂的有价值的工具。

关键词 ：SARS-CoV-2  人类ACE2转基因小鼠  COVID-19 肺炎

简介：2019年12月，武汉市报道了一种冠状病毒疾病（后来称为COVID-19），该疾病在中国迅速传播，然后在世界许多其他国家蔓延。我们和其他小组迅速将病原学鉴定为一种严重的急性呼吸综合征相关冠状病毒（SARSr-CoV），称为SARS-CoV-2。住院患者表现出肺炎的症状 ， 胸部CT扫描发现异常。包括发烧，咳嗽，呼吸困难，双侧肺浸润和淋巴细胞减少在内的典型疾病迹象与SARS和中东呼吸综合征（MERS）患者的症状相似。冠状病毒是有包膜，无节段的正义RNA病毒。。冠状病毒亚科中有四个冠状病毒属，即α冠状病毒属、β冠状病毒属、，δ-冠状病毒属和γ-冠状病毒属。人类冠状病毒属于α冠状病毒属和β冠状病毒属，除引起严重呼吸综合征的SARS-CoV和MERS-CoV两种高致病性病毒外，通常引起轻度呼吸系统疾病。因此，SARS-CoV-2是第七种人类冠状病毒和第三种高致病性冠状病毒。SARS-CoV-2与SARS-CoV-BJ01具有79.5%的nt序列同源性，并使用相同的受体血管紧张素转换酶2（ACE2）进入细胞。先前的一项研究表明，SARS61-CoV野生型在小鼠中复制不良，需要通过连续传代或转导进行小鼠适应或开发表达人ACE2的转基因小鼠模型。尽管SARS-CoV-2与SARS-CoV的受体结合域（RBD）结构同源，但已有的几种SARS-CoV RBD单克隆抗体不能中和SARS-CoV-2，表明这两种病毒之间的交叉中和保护作用有限。当前，没有针对SARS-CoV-2的特异性抗病毒治疗，其测试通常依赖于动物感染模型。动物模型对于理解病毒的发病机理，疫苗开发和药物筛选至关重要。非人类灵长类动物（NHPs）对临床前评估至关重要。 但是，NHP的应用受到高成本，高可用性以及所需饲养设施的复杂性的限制。因此，合适的小动物模型对于研究和抗病毒治疗的发展至关重要。小鼠模型之所以受欢迎，是因为它们的可负担性，可用性和明确的遗传背景，已被广泛用于研究人类冠状病毒的发病机理。我们先前的研究表明，SARS-CoV-2可以利用人、蝙蝠或麝香猫ACE2作为细胞受体，而不能使用小鼠ACE2。 看来表达hACE2的小鼠是一个合理的选择。在肺纤毛上皮细胞特异性HFH4/FOXJ1启动子的调控下，构建了表达人ACE2的转基因小鼠模型（C3B6小鼠中的HFH4-hACE2）。HFH4-hACE2小鼠在肺中表达高水平的hACE2，但在其他组织（包括脑，肝，肾和胃肠道）中的表达水平却有所不同。这些小鼠已用于评估SARS-CoV和蝙蝠SARSr-CoVs的发病机理。尽管某些小鼠死于致命性脑炎，但体重减轻20％以上的受感染小鼠在肺和脑中仍保持强劲的病毒RNA复制。在这里，我们评估了SARS-CoV-2感染后HFH4-hACE2小鼠的感染性和病理变化。

结果：

SARS-CoV-2感染可诱发HFH4-hACE2转基因小鼠肺炎的病理特征

SARS-CoV-2使用人ACE2作为其细胞受体，而不是小鼠ACE2。SARS-CoV-2感染可诱发HFH4-hACE2转基因小鼠肺炎的病理特征。HFH4-hACE2小鼠分别鼻内感染3 * 10⁴ TCID50病毒，并在感染后（DPI）第1、3、5和7天处死以收集组织和血液样本。 将四只小鼠（两只雄性和两只雌性）用作对照动物。. 在感染组，进行终点数据分析时4只小鼠被排除在外，其中2只未被感染（所有组织中的病毒RNA均为阴性），另外2只死于手术并发症。用小鼠外周血进行血常规和生化分析。在感染的最初三天没有明显的临床症状，只有一只雄性鼠（G-D5-M2）在第2天出现呼吸窘迫，但后来恢复。感染后4 天小鼠表现出两种不同的临床表型。感染后4天发现一只小鼠（G-D5-M3）死亡，两只体重减轻，感染后5天并被人道安乐死。剩余的小鼠感染后6天体重减轻，感染后7天并被人道安乐死。总的来说，这四只小鼠从感染后第4天到第6天显示出明显的体重下降，并在死亡或人道安乐死之前产生了明显的呼吸窘迫和神经系统症状。所有剩余小鼠均存活至终点，无明显症状。

白细胞（WBC）分析表明，与对照组相比，感染组外周血中性粒细胞和单核细胞的水平在第1天开始升高，在第3天达到高峰，感染后5天和7天降低。感染后1天的小鼠显示淋巴细胞比率降低。但是，淋巴细胞比率从感染后3天开始恢复。 所有垂死的小鼠（死或丢失的体重> 20％）均显示淋巴细胞数量显著减少，这是COVID-19患者的关键临床标志之一。5只小鼠的肌酸激酶水平明显高于对照组，这可能与肌肉疲劳、疼痛或心肌炎有关。死亡小鼠的天冬氨酸转氨酶和肌酸激酶水平高于对照组。这些数据表明，SARS-CoV-2感染小鼠产生的症状与人类感染症状部分相似。

我们使用组织学分析方法检查这些小鼠是否患有肺炎。 将感染小鼠的左叶固定，切片并用苏木精-曙红染色。来自一只健康小鼠的同组织用作阴性对照。 在整个感染过程中，病理切片显示不同程度的肺炎。在1 DPI时，同对照组相比，在感染小鼠的肺组织中观察到一些细微变化，包括较小的多灶性病变，一些肺泡壁增厚，单核细胞和淋巴细胞浸润以及一些肺泡空间中巨噬细胞和淋巴细胞的数量增加，纤维蛋白少量渗出。3DPI时出现中度间质性肺炎，包括多灶性病变，支气管周围和血管周围炎性细胞（淋巴细胞和单核细胞）浸润增加，成纤维细胞增生，部分肺泡渗出纤维蛋白和蛋白水肿。5 DPI后观察到两个不同的类别。 8只小鼠（72.7％）在5 DPI和7 DPI时仅表现出轻度的支气管周围和血管周围浸润，而其他三只（27.3％）则患有更严重的肺炎。在后一类中，小鼠肺持续表现为大量支气管周围和血管周围混合炎性细胞浸润、纤维增生或组织、充血、水肿伴透明膜形成，部分终末细支气管阻塞，部分肺泡细胞在感染后5天、7天和死亡时溶解和坏死。定量病理评分与HE病理观察结果趋势一致。与对照组相比，组织样本经MSB染色后，肺中也观察到透明血栓和纤维蛋白。由于较高的肌酸激酶可能是由心肌或肌肉损伤引起的，因此我们检查了心脏组织的组织学。感染小鼠心脏组织中部分心肌细胞和部分坏死心肌细胞出现水肿。综上所述，SARS-CoV-2感染成功地在hACE2小鼠中诱发了肺炎，并且肺的组织学特征与重症患者非常相似。

SARS-CoV-2在感染小鼠中的组织嗜性

为了更好地了解hACE2小鼠中的病毒复制，通过RT-qPCR对来自分别对感染后1、3、5和7 天和安乐死的小鼠的不同组织中的病毒RNA进行了定量。从感染后1天开始在所有肺中检测到病毒核酸，然后缓慢增加直至感染后5天，然后从感染后7天开始降低。我们还分别在八只和两只被感染的小鼠的眼睛和心脏中发现了低病毒RNA拷贝。其他器官未检测到病毒RNA。用以前用于SARS-CoV-2检测的交叉反应抗体进行免疫组织学检测，在肺的支气管上皮细胞和肺泡细胞中检测到病毒抗原。值得注意的是，其中四只动物表现出SARS-CoV-2对大脑的神经侵袭，但仅在死亡的老鼠上发现。但是，尚不清楚调节SARS-CoV-2神经入侵的确切细节和机制，因为这种现象先前已在此小鼠模型中进行了描述。 然后，我们尝试从受感染的动物中重新分离出SARS-CoV-2。我们用感染小鼠（G-D7-M1）的肺和脑匀浆上清接种Vero E6细胞，观察感染细胞与对照组相比有明显的细胞病变。通过间接免疫荧光测定（IFA）和基因组测序证实了G-D7-M1从肺和脑中分离出的病毒。与SARS-CoV-2-WIV04的基因组相比，肺分离物显示出两个突变，即C14554T（nsp13，L372F）和C23525T（spike，H644Y）。与在线BLAST鉴定的已发表病毒序列相比，nsp13处的突变是独特的。刺突基因中的突变位于刺突基因的S1区域的末端。 使用BLAST从美国患者分离出的SARS-CoV-2基因组序列中鉴定出此突变。这些脑分离株在刺突基因的S1区仅表现出一个突变，即C23525T（H644Y）。通过连续稀释VeroE6细胞株确定，被感染的肺中病毒滴度范围为每克组织9.4×103至9.1×105 TCID50。最后，SARS-CoV-2主要在小鼠肺中复制，尽管它也可能靶向hACE2小鼠的大脑，心脏和眼睛。仅在死者的小鼠中观察到脑部感染，这表明神经入侵在该模型中是偶发性的，并且很可能代表了死亡原因。在感染SARS-CoV的其他转基因小鼠模型中也报道了类似的发现。

存活的小鼠对大剂量SARS-CoV-2的再感染具有抵抗力

接下来，我们评估了该hACE2小鼠模型是否可以用作测试针对SARS-CoV-2感染的治疗剂性能的平台。我们设计了一个实验来测试存活SARS-CoV-2感染的小鼠是否对再感染产生抵抗力。感染组在同一时间通过相同的感染途径以相同的病毒剂量感染了六只小鼠。感染后，三只小鼠死亡于感染后第6 天。 所有死者的小鼠都是雄性，总死亡率为50％（3/6）。通常，有两种感染结局，一种是由于感染后第4或5 天体重减轻了20％以上而最终死亡的，另一种是体重减轻少于10％而存活下来。同样，所有死亡的小鼠在死亡前都会产生明显的神经系统症状。观察感染后存活的3只小鼠，1只雄性，2只雌性，共21天。这些小鼠产生了抗SARS-CoV-2的抗体，在1:10到1:40的稀释液中可以中和100个TCID50病毒。然后，我们用7 * 10⁵ TCID50病毒/每只经鼻内感染了三只SARS-CoV-2幸存者和另外三只健康小鼠。先前所有的幸存者也都在第二次感染中幸存下来。 同时，三只未受感染的小鼠中有两只雄性和雌性动物从感染后第4天至第5天表现出体重快速减轻，并分别于感染后第4天和第5天死亡。感染后5天对所有小鼠实施安乐死以评估病毒滴度以及肺和脑组织的病理变化。与未感染动物相比，幸存者的肺部病毒RNA拷贝明显较低，并且没有任何神经入侵的迹象。再感染的幸存小鼠的肺组织病理学显示中等程度的炎症浸润。相反，在单纯感染组中观察到了分支周围和血管周围的炎症浸润，透明膜的形成以及一些末端细支气管的阻塞。与单纯感染组相比，在幸存小鼠的肺和脑组织中检测到有限的病毒抗原。死亡小鼠由于高剂量的病毒攻击而表现出全身感染。这些数据表明，预先暴露于SARS-CoV-2可保护小鼠免受致命的SARS-CoV-2再感染，这突出了该模型在未来治疗研究中的价值。

讨论：作为一种具有成本效益且易于操作的动物模型，小鼠被广泛用于生物医学研究。已经产生了各种转基因小鼠，以满足不同项目的需求。野生型小鼠的ACE2表达水平较低，这限制了它们作为SARSr-CoVs感染模型的用途，该病毒使用ACE2作为受体。以往的研究表明，HFH4-hACE2小鼠易感染SARS-CoV和bat-SARSr-CoV-WIV1，表明该模型可用于评价以ACE2为受体的所有SARSr-CoV的致病性。在这项研究中，我们成功地使用这些转基因小鼠建立了SARS-CoV-2感染模型。在我们的结果中，被感染的小鼠有两种不同的结果，即恢复和死亡。仅在死亡和重病小鼠中观察到明显的体重减轻。因此，体重减轻可以作为监测疾病进展的良好指标。我们的结果提供了有力的证据，表明SARS-CoV-2感染可能在表达hACE2的小鼠中引起典型的间质性肺炎，并且后代病毒可以从患病的动物组织中重新分离出来。COVID-19患者通常表现出肺炎，典型症状包括发烧，咳嗽，呼吸困难和双侧肺浸润。肺活检显示一名患者的肺细胞明显脱落并形成透明膜。SARS-CoV-2感染后，表达ACE2的小鼠表现出明显的间质性肺炎并伴有炎性细胞浸润。小鼠严重肺炎伴有纤维组织增生、组织增生、充血、水肿及透明膜形成。部分肺泡细胞溶解坏死，部分终末细支气管阻塞，模拟COVID-19患者的病理改变。在常规血液检查中，淋巴细胞减少是COVID-19患者的一个共同特征，有些患者有高水平的AST和CK。SARS-CoV-2感染小鼠的血常规检查结果与人类患者不完全一致，而表观淋巴细胞减少仅见于死亡小鼠。在我们的小鼠模型中，雄性小鼠的死亡率远远高于雌性，这部分反映了人类观察到的感染结果。在感染SARS-CoV的小鼠中发现了基于性别的易感性差异，这表明雄性小鼠比雌性小鼠更容易感染SARS-CoV。与SARS-CoV感染相比，感染SARS-CoV-2的HFH4-hACE2小鼠死亡率较低，但肺组织中的病毒滴度相当，这可能部分反映了SARS-CoV-2患者的死亡率较低。

我们还证明，尽管眼睛，心脏和大脑也可能受到感染，但肺是该病毒的主要攻击目标。在人类病例中，怀疑SARS-CoV或SARS-CoV-2也会攻击眼睛，心脏和大脑，但是，只有有限的数据可用。我们的研究警告说，应特别注意这些病毒靶标，特别是因为大脑和眼睛可能会持续感染其他急性RNA病毒，例如埃博拉病毒。在COVID-19患者中，病毒感染的器官倾向性报道较少，但SARS患者中多器官感染的报道较多。在我们的小鼠模型中，病毒RNA主要在低病毒滴度感染的肺组织中检测到。与之相比，病毒感染剂量越高，阳性组织越多，与HFH4-hACE2小鼠组织ACE2的表达一致。在体重快速下降的小鼠脑内发现高病毒RNA，这与HFH4-hACE2小鼠感染蝙蝠SARSr-CoV和SARS-CoV的结果一致。考虑到SARS患者大脑中已报告SARS-CoV，SARS-CoV-2攻击后小鼠脑部感染支持了患者潜在的脑部感染。最近，从SARS-CoV-2患者的眼液中分离出病毒，这证实了我们在小鼠模型中的发现，并暗示了潜在的基于眼睛的感染和传播途径。

感染后存活的小鼠产生低滴度的中和抗体（1:10至1:40）。用更高滴度的病毒（7 * 10⁵ TCID50 SARS-CoV-2）再感染，只会在存活的小鼠中引起轻度肺炎。相比之下，那些单纯感染的老鼠患有严重的疾病，肺和脑组织中的病毒RNA拷贝数要高得多。目前尚不清楚中和抗体或体液免疫引起了观察到的保护作用。未来的研究需要确定细胞免疫是否也有助于防止再次感染。

总之，部分模拟COVID-19病理的人类ACE2小鼠模型将成为测试疫苗和其他潜在疗法的宝贵平台。尽管该模型存在致死性脑炎等缺点，但在中枢神经综合征出现之前，该模型也是研究发病机制和治疗潜力的合适选择。还应使用SARS-CoV-2验证其他小鼠品系，包括先前已通过SARS-CoV和MERS-CoV感染进行过测试的不同年龄的小鼠。其他研究人员测试了SARS-CoV-2在几种动物中的易感性。结果表明：SARS-CoV-2可以感染仓鼠，雪貂和猫，导致轻度症状，但不能感染猪，鸡或鸭。SARS-CoV-2在全球范围内的传播，人们迫切需要冠状病毒疫苗和治疗方法。。 成功建立COVID-19发病机制的动物模型对于评估抗击SARS-CoV-2的疫苗和治疗剂将具有重要的价值。

局限性

HFH4-hACE2小鼠对SARS-CoV-2的感染表现出性别敏感性。应该为不同性别的小鼠确定SARS-CoV-2的LD50。死亡小鼠表现为脑感染，可能不反映SARS-CoV-2在人类中的发病机制。未来的研究应该找出病毒在感染小鼠中的持续时间。 应测试老年小鼠对SARS-CoV-2感染的敏感性。

原文出自：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S009286742030622X