斑马鱼对各种气味的刺激特异性行为反应表现出个体差异性

摘要：背景：气味驱动的行为，如喂养，交配和躲避捕食者，对于动物的生存至关重要。处理这些行为的神经途径已经在许多物种中得到了很好的表征，在特定气味刺激嗅球后参与不同脑区的活动。虽然已很好地理解斑马鱼的嗅觉回路，但是需要一个将气味驱动的行为与特定气味联系起来的综合特性来更好地将嗅觉计算与动物的反应联系起来。结果：我们使用中等流量装置测量了10条斑马鱼应对17种生态相关气味的游动轨迹。通过选择合适的运动指标，我们构建了描述气味引起的游泳轨迹变化的行为图。成年斑马鱼对大多数气味的反应使用不同的行为程序，结合一些相关的行为指标，使我们能够捕捉到这些先天气味反应的大部分差异。天然食品的单个成分和警报气味无法引起完整的行为反应。 最后，我们表明斑马鱼的血液引起了显著的防御行为，类似于皮肤提取物引起的行为，并激活了空间重叠的嗅球区域。结论：我们的研究结果突显了气味驱动行为在斑马鱼个体内和个体间的显著差异性，并确定了引起强烈反应的少量水性气味。我们的行为设置和结果将为将来的研究提供有用的资源，这些研究有利于表征水生动物的先天嗅觉行为。

背景：气味是鱼类多种行为反应（例如繁殖，觅食和防御行为）的强大驱动力。这些刻板行为背后的神经通路一直是广泛研究的焦点，并得到了很好的描述。由嗅球，后结核和中脑运动区组成的神经通路通过激活保守的脑干运动前神经元（网状脊髓神经元）将嗅觉输入转换为运动输出，进而控制脊髓运动中心。与食物有关的气味激活了参与控制斑马鱼食欲的下丘脑区域，并引起了多种鱼类的觅食行为。在斑马鱼中，警报气味激活位于背内侧（Dm）和腹侧（Vv）端脑以及视前区的核。这些斑马鱼脑区分别与哺乳动物杏仁核、中隔和下丘脑室旁核同源，参与适应性恐惧反应和反捕食行为。因此，准确描述生态相关气味和气味驱动行为之间的联系，是描述产生这些基本行为的神经回路以及它们如何受动物内部状态（如饥饿、恐惧或焦虑）影响的重要一步。矛盾的是，虽然斑马鱼嗅觉回路特征很好，但需要对斑马鱼对生态相关气味的反应行为进行全面描述，以便更好地将嗅觉计算与动物行为联系起来。越来越多的研究已经开始通过描述斑马鱼对气味反应的游泳模式的变化，来识别明显的负（回避）和正（趋近）趋化反应。这些研究调查了对以下一类或两类气味的行为响应：与食物有关的气味，与社会有关的气味，与腐烂有关的气味（分解肉中的多胺）和警报气味。这种方法无法比较同一个人内所有四种气味类别之间的行为响应，这对于揭示刻板印象和特定于气味的运动程序很重要。没有比较同一个体对与腐烂有关的厌恶性气味和警报性气味的反应。在鱼类群中测量了气味驱动的行为，从而掩盖了气味敏感性或偏好方面潜在的个体间差异，或者没有对个体间差异进行量化。因此，非常需要测量和分析单个鱼对各种气味的行为响应。我们使用中等流量设置表征斑马鱼的气味驱动行为，从而允许暴露于明确定义的气味浓度下。利用这种方法，记录了10条鱼对17种生态相关气味的游动轨迹。通过选择七个合适的运动指标，我们构建了行为图，系统地描述了气味引起的游泳轨迹变化。鱼对大多数气味有不同的行为反应。几个相关行为指标的组合足以捕获这些先天气味响应中的大部分差异。相似种类的气味引起微弱的集群行为反应。此外，我们量化了气味驱动行为的个体内和个体间的差异性，并提出了一组能引起强烈反应的气味。我们证明了同种血液和警报气味“皮肤提取物”引起了非常相似的防御行为，并激活了背外侧嗅球中的重叠区域。

结果：垂直嗅觉装置，可精确控制气味浓度并快速切换气味：

为了重复测量鱼类对各种气味的反应，我们建立了一个计算机控制的装置，自动记录自由游动的个体鱼的位置。水箱内有400mL的水，沿水平轴测得15cm，沿垂直轴测得11.5cm，宽3 cm（约6×5×1的鱼体长度），我们能够从垂直和水平两个维度调查斑马鱼的位移。调整流速为90 mL / min，该速度足够快，但又不足以使鱼体疲惫或紧张。此外，一个T形连接件将流入的水转向侧壁。为了避免把鱼冲到底部，使刺激物在水箱内快速均匀地分布。为了描述传递到水箱的气味的开始和动态，我们用染料代替它，并测量反射光随时间的变化。染料在阀门打开8秒后到达竞技场，并迅速在竞技场中扩散，在30 s内覆盖其全部体积。在15分钟内染料浓度恢复到刺激前的水平。基于此，我们选择了20 min的试验间隔时间，以确保在开始以下记录之前完全清除先前的气味。

a 使用计算机控制的电磁阀将气味快速传递到水箱的行为设置示意图  b 图像系列显示阀门打开后，气味在水箱内迅速均匀地扩散。

斑马鱼对不同气味反应特性的研究：

鱼依靠不同种类的水溶性气味来指导生存所必需的行为。因此，我们选择了与生态相关的气味，这些气味与以下四类相关：进食、社交、腐烂和警报气味。我们使用了七种不同的与食物有关的气味：五种氨基酸，它们是引起觅食的物质。表示食物新鲜度的核苷酸混合物。以及从鱼食片中提取的食物成分。社会气味由商业上可买到的化学物质组成，这些化学物质存在于鱼的排泄物中：胆汁酸的混合物，引导海鳗到产卵地。氨和尿素，它们是鱼尿中的代谢物。前列腺素2α，通过排卵释放出的鱼类生殖信息素。腐胺、尸胺和精胺是三种富含腐肉的胺，斑马鱼可以避开这三种胺。最后，警报气味由斑马鱼皮提取物组成。硫酸软骨素，鱼皮提取物的一种成分，引起斑马鱼的报警反应。斑马鱼血，一种可能的警报气味，引起罗非鱼的防御行为。为了表征斑马鱼的气味驱动行为，然后我们针对这17种气味和水控制措施，测量了10条成年鱼（七雄和三雌）的游泳轨迹。在每天的录像记录前，一条鱼在上述水箱中适应45分钟。在每次持续10 分钟的单独记录中，最初的5分钟不释放气味，后释放气味。绘制鱼的位置，得出代表斑马鱼在气味暴露期间的游泳位置的平均占用率图，这些图在不同的气味剂之间差异很大。特别是，食物提取物、核苷酸和蛋氨酸等进食线索诱导了对水箱上部的探索，这是气味最初传递的地方。相比之下，鱼儿在水箱底部游动，以应对血液和皮肤提取物等气味。 为了检查某些气味是否比其他气味引起更多的刻板印象，我们量化了每种气味中单条鱼的平均占有率图的相似性。

成年斑马鱼对生态相关气味的空间响应。 代表斑马鱼在气味暴露过程中游泳位置的平均占用图 a食品相关气味 绿色 b社会相关气味 蓝色 c 腐烂气味 品红色 d警报气味 红色

总体而言，除了靠近侧壁的活动增加以外，与进食和社交气味相对应的平均占用率图与水对照相比没有明显差异。这可能是由于这些类别内的重要异味变化。响应警报气味的平均占用率图显示，即使对腐烂气味的响应程度较低，也可以观察到底部潜水的持续增加，尽管幅度较小。

用行为测量法量化气味反应：

为了量化斑马鱼响应气味的运动行为的动力学，我们计算了气味引起的鱼速度，突然游泳次数和突然转弯次数以及水平和垂直游泳事件的变化。为了量化气味的效力，我们还计算了减少勘探的度量标准的变化，例如冻结时间和沿垂直轴的位置，这反映了斑马鱼的恐惧和防御行为。举例说明了个别鱼对所选气味的代表性反应。使用这些指标，我们建立了行为图表，系统地描述了各种气味引起的变化。发现向水箱输送水后，均无任何行为指标变化，表明由于阀门的打开和关闭而导致的流量或振动的微小变化不会触发行为响应。

量化成年斑马鱼对生态相关气味的行为反应的度量。 气味释放后的前2分钟内七个行为反应指标的变化 。a速度，b突发游泳的百分比，c突然转向的次数，d水平游泳，e垂直游泳，f冻结，g垂直位置

我们观察到四种食物气味、两种社会气味和精胺对游泳速度的显著影响，其特征是速度和突发游泳的次数增加。响应于两种腐烂气味，突然转向的数量显著增加，可能表明游泳不规律。有趣的是，血液也引起急转向的增加。在觅食和产卵方面，已观察到几条鱼的游泳策略有所变化，尤其是水平和垂直游泳的数量。在这里，我们观察到响应尿素和软骨素水平游泳的时间减少了。 有趣的是，食物提取物引起水平游泳的数量增加，让人联想到觅食行为。响应尸胺，腐胺和精胺这三种腐烂气味，上下垂直游泳明显增加。值得注意的是，仅仅在暴露于17种气味中的两种气味（皮肤提取物和血液）时，与防御行为（在水箱中的冻结和垂直位置）相关的指标就被显著地调节。对血液的反应，冻结所花费的时间和在水箱底部所花费的时间有所增加，类似于对皮肤提取物的反应。因此，同种属血液会引起斑马鱼对皮肤提取物的一整套报警行为，因此是一种新的和同样强烈的报警气味。为了确定我们的一系列行为指标是否捕捉到气味反应的独立方面，我们在气味响应期间计算了它们的平均成对相关性。如预期的那样，冻结与大多数活动运动指标和垂直位置呈负相关，这反映了大部分冻结发生在水箱的底部。除了与速度强烈相关的爆发式游泳外，大多数指标都显示出相对较弱的相关性，这表明它们捕获了气味诱发行为的独立方面。大多数指标在鱼之间存在显著相关性。特别是，由我们的气味引起的最刻板的反应是冰冻、垂直游泳和在水箱中的垂直位置。

斑马鱼个体和斑马鱼之间对气味反应的差异性：

个体内和个体间行为的差异性是动物反应的重要方面，它量化了可观察到的行为可重复性。在我们的实验中，我们观察到斑马鱼个体之间的不同反应。例如，一条鱼表现出不同于大多数其他鱼的行为反应。尽管个体之间存在这种可变性，但是个体对相同气味的不同呈现方式做出的响应之间的试验间差异很小，表明可重复性高。例如，响应于血液的冻结和垂直位置的模式以及响应于皮肤提取物的突然转弯的次数在不同个体间可能非常相似。但是，并非所有的气味都如此，这表明只有少数几种特定的气味可能会在鱼体内产生可再现的行为。为了量化气味反应在整个试验中是否可重复，我们测量了对气味复制的行为反应之间的平均相关性。大多数气味引起弱相关反应。尸胺，血液，皮肤提取物，食物气味和胆汁酸在整个试验中显示出更高的相关性，范围从0.37到0.59，这证实了特定的气味可以在单个鱼体内引起可再现的反应。为了确定气味是否在不同的鱼身上引起相似的反应，我们计算了所有鱼对个体气味反应的平均相关性。我们观察到，硫酸软骨素、尸体胺、腐胺和尿素在鱼类中引起了最可重复的反应。

斑马鱼个体气味反应的差异性。

根据行为指标对气味进行分类：

我们将使用上述所有行为指标的组合，根据行为反应对气味进行分类。由蛋氨酸，组氨酸和苯丙氨酸组成的氨基酸不会引起与水对照显著不同的响应，这可能是由于食品提取物中这些单独成分贡献的进食行为。第二种氨基酸，由半胱氨酸和精氨酸组成，与衰变相关的胺精胺聚集在一起。第三部分，仅由天然饲料气味，食物提取物组成，引起了与其氨基酸成分不同的行为反应。同样，尽管两种报警气味（血液和皮肤提取物）聚集在一起，明显不同于所有其他气味剂，但单分子报警气味硫酸软骨素不会。

警报气味，皮肤提取物和特定的血液激活了空间重叠的嗅球区域：

我们的行为数据表明，斑马鱼可以闻到血液并表现出防御行为，类似于由常用警报气味，皮肤提取物引起的反应。为了研究同种异体的血液是否激活了斑马鱼的嗅觉系统，使用双光子钙成像技术，测量了嗅觉球对部分气味的反应。我们发现血液和皮肤提取物都能特异性地激活位于嗅球背表面下的前外侧区的嗅球神经元。为了量化气味反应的相似性，我们计算了这些气味的多神经元表征之间的成对Pearson相关。分析表明，血液和皮肤提取物在嗅球背侧诱发的神经反应与食物提取物、胆汁酸和生理盐水对照组所诱发的神经反应非常相似。这些结果首次揭示，同种血液特异性激活斑马鱼背嗅球，其模式类似于常用的警报气味皮肤提取物。皮肤提取物和血液引起的相似行为反应也表现出高度相似的神经激活模式。

斑马鱼的血液和皮肤提取物在嗅球背侧引发高度相似的神经活动。

结论：我们的中等流量分析提供了一种低成本且开放的设置，可再现地测量对鱼类中多种气味的气味驱动行为。 使用这种方法使我们能够收集到空前的嗅觉反应，这些反应涵盖了成年斑马鱼的自然刺激空间。我们证实了先前描述的对经典气味剂的行为反应，并表征了一种新的强力报警物质（血液）。我们也为未来研究提供建议，以考虑气味驱动行为的个体间和个体内差异性。未来的研究将需要进一步探索斑马鱼嗅觉行为中个体差异的神经基础。

原文出自：https://link.springer.com/article/10.1186/s12915-020-00801-8