自21世纪以来，关于干细胞的基础研究和应用始终是国内外科研领域的一大热点。根据我国国家自然科学基金网站的数据，每年批准的干细胞相关的国自然课题数量从2009年开始直线上升，并在2016年达到顶峰（658个），最近几年则仍保持在平均每年500-600个的较高水平，可见干细胞研究的火热。

与普通成体细胞不同的是，干细胞具有自我更新和多向分化潜能的特性，这种特性让干细胞在某些领域的研究具有其他细胞所不具备的优势。此外，近年来以干细胞为实验对象的研究，极大地加深了生物学家对基因转录、翻译及表观遗传学调控等生命现象本质的认识，也推动了细胞克隆、转基因、基因编辑等现代生物技术的发展，同时，干细胞技术也为一些难治性疾病的临床治疗提供了新的思路。

认识间充质干细胞（MSC）

在众多干细胞中，MSC是研究和应用最广泛的一类，来源于胚胎发育早期的中胚层，属于多能干细胞。1968年德国科学家Frieden Stein在骨髓中首次发现了MSC的存在，并成功在体外进行培养；1999年Pittenger等首次在体外成功将MSC诱导分化为脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞，证实了MSC的多向分化潜能。2006年，国际细胞治疗协会（ISCT）规范了MSC的定义标准：①可贴壁生长；②细胞表面表达特定的特异性标记物；③具有向脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞分化的能力。

MSC在机体中含量虽然不多，例如骨髓中每1~10万个单个核细胞中仅有1个骨髓MSC，但这极小比例的MSC却在生命活动中发挥了重要的作用。且MSC分布广泛，截止到目前，科学家已在骨髓、脂肪、脐带、牙髓、皮肤等多种组织中均发现MSC的存在。

MSC的临床应用

MSC的临床应用十分广泛，主要集中在3个方面：①直接细胞移植治疗；②作为一种理想的靶细胞用于基因治疗；③作为生物组织工程的种子细胞。自2009年第一个适用于膝关节软骨缺损修复的干细胞药物上市以来，截止到目前全球获批准上市的干细胞药物已有14个，一半以上是MSC，主要集中在组织修复和自身免疫性疾病。而根据Clinical Trials（由美国FDA和NIH共同建立）的最新数据，全球目前有884项关于MSC的临床研究正在进行，其中处在Ⅲ期的临床试验共50项，其中已完成的有16项，主要疾病种类包括克罗恩病、移植物抗宿主病、心梗、类风湿性关节炎和软骨损伤等。

但目前MSC的临床应用仍存在较多挑战，虽然已经明确一些MSC的适应症并观察到不错的治疗效果，但MSC发挥作用的调控机制仍有许多环节不明确。另外在我国，还没有建立统一的MSC制备标准，临床转化过程中存在较大风险。

MSC的培养与鉴定

相比于胚胎干细胞或神经干细胞，MSC具有易获取、易体外培养、传代稳定性、低免疫原性等优势，在体外经过多次传代后仍具有多向分化和自我复制的潜能，且MSCs多来自于成年的组织，研究过程的道德和伦理学问题较小。

MSC的大小与形状具有异质性，即不同种属或不同组织的MSC具有不同的生长形态，例如三极形、长梭形、小圆形、短梭形和扁平形态。几乎所有的MSC都是贴壁生长，具有较强的贴壁能力，而MSC的原代分离也正是利用了MSC强贴壁的特性。例如，骨髓MSC的分离方法为：将从组织中分离出来的单个核细胞悬浮培养于含有FBS的培养基中，1~2天后去除非贴壁细胞，保留贴壁细胞再培养2-3周即可获得。此外也可采用免疫磁珠对MSC进行分选，但这种方法成本较高。

对于MSC的鉴定，常采用的方式包括形态学鉴定，表面标志物鉴定和多系分化潜能鉴定。MSC一般呈纤维细胞样生长，细胞在支持物表面呈梭形或不规则三角形生长，细胞中央有卵圆形核，胞质向外伸出2-3厘米长短不同的突起。MSC的细胞表面标志物则常采用流式细胞仪进行鉴定，不同组织来源的MSCs可共享相同的细胞表面标记，如CD29和CD44。但目前我们对MSC表面分子标志物的研究还不完善，已发现的表面标志物也存在特异性不强的问题，为了让我们更好地分离、培养和鉴定MSC，需进一步不断发现新的特异性标志物。

影响MSC细胞生长的主要因素

相比于细胞系，干细胞对其生长条件要求更为苛刻，稍不注意可能就导致细胞生长速度过慢。那么在培养MSC过程中应注意哪些影响因素呢？

1、血清。血清的质量对MSC的扩增起重要作用，优质的血清可保持MSC高增殖能力并维持分化潜能。

2、接种密度。传代的密度过低会减弱细胞的自分泌和旁分泌作用，密度过高则有可能出现接触抑制，从而导致生长缓慢。

3、细胞因子。在基础培养基中添加一些细胞因子有助于维持MSC的增殖和未分化状态。

4、细胞消化时间过长，胰蛋白酶作用时间太长导致细胞贴壁和生长状态较差。

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