在哺乳动物胚胎发育的过程中，多能细胞迅速分裂分化，但是每个器官细胞谱系的调控程序仍不清楚。近日，中科院动物研究所刘峰课题组与剑桥大学、加州大学圣地亚哥分校的研究人员在《Nature Cell Biology》杂志上合作发表了题为“Single-cell chromatin accessibility maps reveal regulatory programs driving early mouse organogenesis”的文章，利用单细胞染色质图谱分析技术，对哺乳动物器官发育的分子调控机制有了新的认识。

 E8.25小鼠胚胎的单核染色质图谱

对于小鼠而言，8天左右的胚胎日龄是细胞类型多样化的关键时期，因为大多数主要器官的前体细胞已经形成。不过，由于早期胚胎中的细胞数量很有限，也缺乏标志物蛋白来区分各种细胞，人们很难对其进行分析。近期出现的单细胞分子图谱绘制技术，终于让人们有机会对早期器官发生时的细胞复杂性有了全面的认识。

在这项研究中，研究人员首先利用单核ATAC-seq技术，绘制了来自10个小鼠胚胎（E8.25）的19,453个单细胞核的染色质开放性图谱（图1a）。他们合并所有数据并进行peak calling，以此来定义开放的染色质区域（OCR），并将峰的列表与已知的转录起始位点（TSS）合并来鉴定稀有的细胞群。

通过这种方式，他们生成了18个细胞群，覆盖三个胚层和胚胎外组织（图1b）。为了进一步评估数据质量，他们研究了α-珠蛋白基因簇，该簇由胚胎（Hba-x）和成体（Hba-a1和Hba-a2）珠蛋白基因组成，其上游增强子（R1–R4和Rm）的特征明确。他们发现，仅红系细胞簇的增强子可开放（图1c），也只有胚胎Hba-x基因处于开放染色质中，与成体基因形成鲜明对比。

图1. 早期小鼠器官发生的单细胞染色质图谱 

细胞特异性的染色质图谱

接下来，研究人员定义了细胞类型特异性的染色质，用于鉴定常见的生物学过程。他们以19,453个细胞核作为变量，利用其开放性差异来观察305,187个基因组区域。图谱显示了细胞特异性的开放染色质区域在不同部位的分离（图2a）。

同时他们还发现，相同胚层特有的开放染色质区域是相邻的，而神经中胚层前体细胞（NMP）的开放染色质区域位于脊髓和体壁中胚层之间，因此反映了发育谱系的关系。细胞特异性的开放染色质区域主要位于基因间和内含子，而那些普遍存在的区域（在超过25%的细胞核中存在）则大多与启动子重合（图2b）。

图2. 细胞特异性的染色质图谱 

两个TAL1结合的内皮增强子

成长中的小鼠胚胎严重依赖于早期循环系统的建立，以获得充足的氧气。血液和内皮的发育通过共同的前体细胞、标记基因、调控信号和蛋白密切关联。在早期的小鼠胚胎中，第一波的原始血细胞大概是在E7.5从中胚层前体中产生的，瞬时表达与内皮相关的基因。随后，在E8.25左右，第二波得原始血细胞是从形成的内皮细胞中产生。

为了评估一些内皮细胞如何向血液转化，而其他内皮细胞如何从尿囊中产生，研究人员重新评估了标注为尿囊、红系和内皮的开放性图谱。通过UMAP分析，他们观察到一系列内皮细胞向血液转化，表明它们具有造血性质。同时，他们还检测到一组可能从尿囊中转化而来的内皮细胞，与之前发表的文献一致。

鉴于转录调控因子TAL1能破坏first and second blood waves，研究人员接着探索了TAL1结合与染色质开放性有何关联。通过数据分析，他们不仅鉴定出先前发现的内皮增强子Erg+85 kb和Fli1−15 kb，还发现了位于Flt1和Maml3基因的候选增强子（分别为Flt1+67 kb和Maml3+360 kb）（图3）。转基因小鼠胚胎（由赛业生物提供）实验表明，E11.5小鼠脉管系统中的两种候选增强子均具有活性，这也显示了细胞特异性的染色质图谱有助于鉴定组织特异性的调控区域。

图3. Flt1+67 kb和Maml3+360 kb是两个内皮特异性的增强子 

Fev参与了血管内皮细胞的形成

正如前文所述，尿囊细胞可以在E8.25转化成内皮细胞。于是，研究人员便利用这种分化过程来研究胚胎发育过程中与内皮细胞建立相关的调控程序。他们发现，ETS转录因子Fev和Etv2聚集在一起，在每个轨迹的中间都有一个特定的表达峰，表明它在胚胎内皮的建立过程中发挥潜在作用。

于是，他们在斑马鱼中开展了体内研究。他们将fev mRNA注入1-2个细胞阶段的斑马鱼野生型胚胎中以评估fev过表达的作用。他们发现，这导致斑马鱼10体节期（10s）的lmo2和tal1上调以及受精后26小时（26 hpf）的内皮细胞标志物flk1上调，而原始造血标志物gata1a没有上调，这支持了fev在赋予内皮特性上的作用。之后的一系列分析也表明，fev为血管内皮细胞发育最初阶段的调控因子。

作者认为，在小鼠和斑马鱼中开展的体内验证实验结果一致，表明单细胞开放染色质图谱有助于人们了解哺乳动物器官发生中的调控机制，这对于干细胞研究和医学领域具有重要意义。

原文检索：

Pijuan-Sala, B., Wilson, N.K., Xia, J. et al. Single-cell chromatin accessibility maps reveal regulatory programs driving early mouse organogenesis. Nat Cell Biol 22, 487–497 (2020).

DOI：https://doi.org/10.1038/s41556-020-0489-9.

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