摘要：世界各国都在努力开发一种针对SARS-CoV-2（严重急性呼吸综合征冠状病毒2）引起的COVID-19的疫苗。一种有效的疫苗应该能够诱导高滴度的中和抗体，以防止病毒附着在宿主细胞受体上。然而，为了激发抗体的保护水平，疫苗可能需要多次注射或来自其他免疫刺激分子的协助。此外，该疫苗应能够以最少的抗原量快速诱导出抗体的保护水平。这降低了疫苗的成本并使其负担得起。 由于该流行病席卷了全球大多数国家，因此在短时间内对疫苗的需求量将是巨大的。在SARS-CoV-2疫苗中加入合适的佐剂可以满足这些要求。本文将讨论使用类似冠状病毒（CoV）进行佐剂疫苗研究的实验结果，这些结果可能有助于SARS-CoV-2疫苗选择合适的佐剂。还讨论了开发针对该疾病的佐剂疫苗的最新进展。

关键词：COVID-19  SARS SARS-COV-2 佐剂 疫苗 冠状病毒 MERS

简介：目前，还没有针对这种疾病的特定抗病毒药物或疫苗；但是，正在进行许多研究和临床试验，以评估各种药物和疫苗候选品的有效性和安全性。由于SARS-CoV-2与SARS和MERS冠状病毒有着显著的相似性，并使用相似的棘突蛋白进行受体结合，因此，过去针对这类类似病毒的疫苗研究的关键信息可能有助于加速开发有效的COVID-19治疗/疫苗。针对SARS-CoV的候选疫苗已在许多研究中进行了测试，包括灭活的全病毒疫苗，重组刺突（S）蛋白制品，病毒样颗粒（VLP），质粒DNA以及几种包含SARS-CoV蛋白基因的病毒载体。许多这种候选疫苗有效地诱导产生中和抗体。这种抗体以冠状病毒的棘突蛋白为靶点，因此它不能与细胞受体结合，因此不能进入细胞。然而，疫苗开发有一些基本的制约因素。疫苗设计的关键因素是确保疫苗的功效，同时减少与其相关的潜在风险。 灭活的病毒疫苗可能不会引发理想的免疫反应以赋予保护性免疫，并且可能需要多次加强免疫。 同样，含有重组病毒蛋白的新一代疫苗需要免疫刺激分子的帮助。此外，与其他RNA病毒一样，这些CoV经常进行重组。因此，减毒活疫苗具有逆转为强毒形式的固有风险，并可能对人类生命构成严重威胁。理想情况下，针对高致病性病毒（包括冠状病毒）的疫苗应能够在短时间内对最小抗原剂量产生保护性抗体反应，且无不良反应。上述大多数问题可以通过在疫苗制剂中加入适当的佐剂来解决，这不仅有助于引起强有力的免疫反应，而且还可能减少抗原数量和对多剂量疫苗的需要。因此，选择有效的佐剂对于开发针对COVID-19的佐剂疫苗至关重要。过去对具有各种佐剂组合的相似冠状病毒的疫苗研究可能提供关键信息，并有助于选择具有良好安全性和功效的佐剂。我们以类似的CoV讨论了过去的佐剂疫苗研究及其结果，这些CoV可能有助于开发针对COVID-19的佐剂疫苗。此外，我们简要讨论了抗COVID-19佐剂疫苗开发的最新进展。

图、由于SARS-CoV-2在基因组水平上与SARS-CoV高度相似，过去疫苗研究的结果可能会加快COVID-19疫苗的研制。

佐剂：氢氧化铝：氢氧化铝是最常用的佐剂。 它的辅助作用机制很复杂，到目前为止，已经提出了多种假设来解释其作用方式。已经显示它通过在注射位点形成贮存库起作用，从而允许缓慢释放抗原。 这延长了抗原与抗原呈递细胞（APC）之间的相互作用时间。此外，它将可溶性抗原转化为易于吞噬的颗粒形式。活化的Th2细胞释放IL-4，进而诱导单核细胞MHCⅡ类分子的表达增加。在细胞水平上，氢氧化铝直接刺激单核细胞产生促炎性细胞因子激活T细胞。用紫外线灭活的SARS-CoV颗粒免疫小鼠，可产生高水平的体液免疫，长期分泌抗体和记忆性B细胞。此外，在疫苗配方中添加氢氧化铝可显着增加血清IgG，并达到与超免疫小鼠相似的水平。在小鼠体内产生的抗体既能识别棘突蛋白，也能识别核衣壳蛋白，并能中和病毒。Tang等用加或不加氢氧化铝佐剂的灭活SARS-CoV对雌性BALB/c小鼠进行了实验，结果表明，加入佐剂的疫苗诱导的SARS-CoV抗体高于未加佐剂的SARS-CoV抗体。在非人类灵长类动物（NHPs）中，在食蟹猴和恒河猴体内注射纯化的SARS-CoV灭活疫苗，可以保护猴子免受SARS-CoV的攻击，而不会引起任何不良反应。同样，用氢氧化铝加CpG佐剂的灭活MERS-CoV疫苗可以保护Ad5-hDPP4转基因小鼠。虽然有研究报道了用灭活病毒颗粒作为疫苗的安全性，但少数报道观察到在接种灭活病毒疫苗后肺部出现抗体依赖性增强（ADE）和免疫病理改变。进一步的研究将免疫病理改变或ADE的发生归因于单独使用灭活病毒疫苗或氢氧化铝免疫诱导的抗N抗体或非中和抗体、抗体同型、低亲和力或中和抗体水平不理想。加入佐剂有利于对全病毒灭活疫苗产生主要Th1反应，可以减轻Th2型免疫病理学的问题。

重组亚单位或更新一代的疫苗近来引起了很多关注。全长重组棘突蛋白加氢氧化铝佐剂的免疫原性与含有棘突蛋白和流感病毒M1蛋白的病毒样颗粒（VLPs）一样具有免疫原性，这两种疫苗都能诱导产生强中和抗体，在小鼠模型中可防止致死性攻击。制备了由SARS-CoV S蛋白和小鼠肝炎病毒E、M、N蛋白组成的嵌合VLPs，并在Balb/c小鼠上进行了抗SARS-CoV攻击实验。在嵌合VLP中添加氢氧化铝佐剂可增强中和抗体的诱导，并保护小鼠免受SARS-CoV攻击。 氢氧化铝佐剂可诱导强烈的RBD特异性抗体反应和更高水平的抗SARS-CoV中和抗体。同样，氢氧化铝佐剂的MERS-CoV纳米粒和重组MERS-CoV-RBD蛋白疫苗可以诱导中和抗体，保护恒河猴。

MF59：MF59是一种水包油型免疫原性佐剂，由角鲨烯和两种表面活性剂Tween 80和Span 85组成。MF59是一种安全，耐受性强且有效的佐剂，已在许多国家/地区用于大流行和季节性流感疫苗。据报道，在流感疫苗中加入MF59佐剂可以诱导更高水平的抗原特异性抗体水平、更高的HAI滴度（抑制血凝反应）和更好的保护。虽然MF59有助于Th2型反应，如氢氧化铝佐剂，但它激活更多的CD4 T细胞，并产生更高的抗体层对抗流感病毒的HA。MF59已被测试为许多其他疫苗的佐剂，以对抗细菌和病毒，包括SARS-CoV。用MF59佐剂的SARS-CoV灭活疫苗免疫小鼠，使其免受病毒的攻击。这种疫苗只注射了2剂就能够诱发中和抗体。以MERS-CoV的S1蛋白和RBD表位为基础的亚单位疫苗与MF59合用时，显著增强了它们的免疫原性，导致IgG的强诱导作用和中和抗体反应。这些制剂保护小鼠免受致命病毒的攻击。开发了多种MF59佐剂的MERS-CoV  RBD候选疫苗，并在小鼠体内进行了试验。这些疫苗能诱导中和抗体，并保护hDPP4转基因小鼠免受致死性攻击。

Montanide ISA-51：Montanide是一种油包水（w/o）乳液，含有矿物油和mannide单油酸家族的表面活性剂。它具有免疫刺激活性，并通过在注射位点形成贮库起作用，导致抗原释放缓慢，局部炎症和抗原呈递细胞（APC）的募集。提高抗体滴度和细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的活性。与FIA（弗氏不完全佐剂）相比，人类对它的耐受性良好，并已在艾滋病（获得性免疫缺陷综合征）、疟疾、癌症和流感的疫苗中进行了试验，取得了不同程度的成功。montanideisa-51与CpG-ODN（寡核苷酸）的联合应用在许多疫苗中具有协同作用，可以增强Th1免疫应答。用montanideisa-51和CpG对重组SARS冠状病毒N蛋白进行乳化。该制剂在小鼠和猕猴体内引起了强烈的Th1免疫应答。合成的SARS冠状病毒棘突蛋白肽与佐剂Montanide ISA-51/CpG组合，在免疫动物体内产生了较强的抗体效价，能够抑制合成的SARS冠状病毒棘突蛋白肽进入HepG2细胞。一种编码SARS-CoV-N蛋白的DNA疫苗与montanideisa-51/CpG佐剂联合应用时，可引起强的N蛋白特异性免疫应答。当MERS-CoV的重组RBD与Montanide ISA-51结合使用时，诱导了高滴度的血清抗体，可以中和细胞培养物中的病毒。montanideisa-51可提高重组刺突蛋白疫苗或S蛋白RBD合成肽疫苗的免疫原性。

AS01B and AS03A：这些是葛兰素史克公司（GSK）开发的水包油佐剂系统。AS01（佐剂系统01）是基于脂质体的佐剂，由单磷酰脂质A（MPL）和皂苷分子（QS-21）组成，而AS03（佐剂系统03）是基于α-生育酚和角鲨烯的佐剂 已用于葛兰素史克（GSK）的A / H1N1大流行性流感疫苗Pandemrix®。 .MPL是从明尼苏达沙门氏菌中提取的，QS-21是从南美树quillajasaponariamolina的树皮中纯化出来的。.MPL通过Toll样受体4（TLR4）发出信号，从而导致APC激活并产生细胞因子和干扰素（IFN）。Q-21被报道可以诱导抗原特异性抗体反应和细胞免疫。与重组SARS-CoV S蛋白同时使用时，Q-21可以诱导高滴度的抗原特异性血清抗体，并可以防止病毒感染。AS01系统已用于新近开发的RTS、S/AS01疟疾疫苗，并在带状疱疹亚单位疫苗、HIV-1多蛋白疫苗和结核病（Mtb72F/AS02候选疫苗）中进行了试验。此外，这些佐剂还用于小鼠和仓鼠的SARS-CoV灭活疫苗制备。AS01B佐剂疫苗的免疫原性略高于AS03A佐剂疫苗。用佐剂免疫动物的疫苗比未加佐剂的疫苗具有更好的保护作用。重要的是，这项研究没有观察到SARS-CoV攻击后仓鼠肺部或肝脏的增强疾病（ADE）。

Delta inulin (Advax™)：Delta inulin（DI）在较高温度下稳定并具有更好的免疫力。它激活补体系统，当与抗原共同给药时，有助于形成一种强有力的抗原特异性适应性免疫反应，包括抗体和细胞介导的免疫（Th0佐剂特性）。当将DI（Advax™）佐剂与灭活的JEV（日本脑炎病毒）和流感疫苗共同使用时，观察到Th1和Th2反应的平衡增强，从而赋予了针对病毒攻击的保护。类似地，当重组刺突蛋白或灭活的SARS-CoV疫苗与delta inulin和CpG寡核苷酸联合作为佐剂共同给药时，该组合显着增强了血清中和抗体的滴度而不会引起肺部免疫病理学，而用氢氧化铝代替delta则没有相同的效果。

TLR激动剂佐剂：TLR是模式识别受体（PRR），可识别与病原体相关的分子模式（PAMP）。与适当配体的相互作用触发促炎性细胞因子和-1型IFN（干扰素）的释放，从而激活先天和适应性免疫系统的细胞，导致抗原特异性增强的体液免疫和细胞免疫。因此，TLR配体作为免疫佐剂在许多人和兽用传染病疫苗制剂中得到了广泛的研究和试验。根据所涉及的信号传导途径，不同的TLR配体诱导不同类型的免疫应答（Th1 / Th2 / Th0）。已广泛用于疫苗佐剂研究的TLR及其配体如下：TLR3（dsRNA），4（LPS），5（Flagellin），7（ssRNA），8（ssRNA）和9（未甲基化的CpG寡核苷酸）。TLR配体已被用于SARS-CoV灭活疫苗的检测，因为有报道称，在活病毒攻击后，用氢氧化铝佐剂的灭活疫苗会导致嗜酸性粒细胞浸润到免疫动物的肺部。TLR配体和疫苗组合可显著减少肺中嗜酸性粒细胞的浸润，从而保护动物。鼻内施用TLR3激动剂poly（I：C）可诱导IFN-β和IFN-γ的产生，并保护动物免受SARS-CoV感染。鼻内注射疫苗后产生的黏膜免疫反应可能阻止病毒进入，并减轻与全身接种灭活疫苗相关的担忧，即肺部的免疫病理学。用灭活SARS-CoV和CpG免疫小鼠，可在血清中产生特异性IgA和中和抗体。

rOv-ASP-1：

许多蠕虫来源的分子已经被证明具有强大的免疫刺激作用，包括ASP-1。据报道，重组ASP-1（rOv-ASP-1）与疫苗抗原一起可诱导Th1和Th2的混合反应；然而，根据抗原的不同，它也可以激活以Th1为主的免疫应答。因此，在需要免疫反应双方的帮助来清除感染的情况下，它可能是有益的。已显示ASP-1可以改善针对市售疫苗（例如流感和狂犬病）的IgG1和IgG2a抗体水平，并且佐剂效果高于传统佐剂氢氧化铝或MPL加TDM。

抗体依赖性增强：

许多研究表明，免疫后动物受到活病毒攻击时，免疫系统就会过度活化。 由于过量释放促炎性细胞因子（细胞因子风暴），例如IL-2，IL-7，IL-8，IL-9，IL-10，IL-17，IL-1β，G- CSF，GM-CSF和TNFα，引起免疫病理改变。ADE或免疫增强是指病毒在粘附抗体的同时进入免疫细胞，导致病毒的传染性和毒性增加。一旦进入细胞（不是通常的靶细胞），病毒就会繁殖并释放后代感染更多的细胞。许多病毒，如登革热、黄热病、HIV和cov已被报道可诱发ADE。大多数证据表明，病毒利用免疫细胞上的Fc受体（FcR）进入，同时附着在抗体的抗体结合位点。抗体的Fc区有一个序列，与表达FcR受体的补体系统或免疫细胞结合。高水平的非中和抗体的存在似乎是引发ADE的主要原因。

结论：以往使用不同佐剂对抗类似cov的疫苗研究所产生的经验和知识可以加速COVID-19佐剂疫苗的开发。佐剂的加入可能会大大减少疫苗中的抗原量，尤其是当候选疫苗是重组刺突蛋白/ RBD蛋白时。到目前为止，还没有确凿的证据表明抗体反应是否足够，或者T细胞反应是否对SARS-CoV-2感染的恢复至关重要。以往对类似cov的研究发现T细胞免疫在清除病毒感染中也起着至关重要的作用。

原文出自：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1567576920313862