提高实验动物育种的选择效率和减少育种过程中的盲目性是实验动物遗传育种工作者的追求目标。近年来，分子标记技术的发展为加速实验动物育种进程带来了新的契机。与以往的表型性状、同工酶分析等方法相比，分子标记直接从 DNA水平检测基因组的遗传变异，不受组织、发育时期、环境限制，且数量极多，多态性高。其中RAPD(random amplified polymorphic DNA，即随机扩增多态性DNA标记)技术具有简便快捷、准确性强等优点，特别是它可以在对物种没有任何分子生物学研究的基础上，对基因组的遗传差异进行分析，且非常适合分析大量群体，因此，它一出现就成为科研工作的有力工具。下面RAPD技术的多态性检测原理及其在实验动物遗传育种上的应用以及存在的问题进行综述。

一、RAPD技术的原理

RAPD标记是以DNA聚合酶链反应(PCR)技术为基础，利用一系列人工合成的、碱基顺序随机排列的寡聚核苷酸单链(通常9～10bp)为引物，以从组织分离得到的DNA为模板，进行PCR扩增。扩增产物经琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，通常用溴乙锭(EB)染色，在紫外透射仪上检测多态性。扩增产物的多态性便反映了基因组相应区域(DNA)的多态性，这样就形成了RAPD标记。

RAPD能够进行多态性检测的原理是：RAPD所用的一系列引物的DNA序列各不相同，但对于任一特定的引物，它同基因组DNA序列有其特定的结合位点。如果基因组在这些区域DNA发生片段的插入、缺失或碱基突变就可以导致这些特定结合位点分布发生相应的变化，而使PCR产物增加、减少或发生分子量的改变。通过对PCR产物的检测即可检测出基因组DNA在这些区域的多态性。由于进行 RAPD分析可用引物数目很多，虽然对每一个引物而言检测DNA多态性的区域是有限的，但是利用一系列引物就可以使检测区域几乎覆盖整个基因组。因此，RAPD从理论上将可以对整个基因组进行多态性检测。

二、RAPD技术的特点

1.RAPD标记技术的优点  RAPD标记技术具有的优点如下：①RAPD是基于PCR方法，继承了PCR的优点，易于实现自动化，它不需要预先克隆标记或进行序列分析，可直接完成多态性DNA标记；②与常规PCR相比，不需要预先知道扩增区域两端的核苷酸序列；与RFLP相比，RAPD技术操作简便、安全。无需专门设计 RAPD扩增反应的引物，随机设计的长度为9～10个碱基的脱氧核糖核苷酸序列均可使用。但是，为了保证退火反应时双链的稳定性，G＋C含量应在40％以上。而常规的PCR反应必须通过已知的序列设计特定的引物，在每个RAPD反应中只加入一个引物，通过一种引物在两条DNA互补链上的随机配对实现扩增；③PCR引物没有种属限制，一套RAPD引物可以应用于任意一种生物的研究，具有广泛性和通用性；④在最初的反应周期中，退火温度较低，一般为36或37℃。一方面保证短核苷酸链引物与模板的稳定配对，另一方面允许适当的错误配对，从而扩大引物在基因组DNA中配对的随机性，提高对基因组DNA进行多态性分析的效率；⑤显性遗传(极少数为共显性遗传)，不能鉴别杂合子和纯合子；⑥操作技术简便，不涉及分子杂交和放射自显影等技术；省工、省力，工作效率高；⑦DNA样品需要量少，引物价格便宜，成本较低；⑧RAPD标记克服了同工酶检测位点少、取样受组织、器官和发育时期影响的缺陷，不受环境、发育、数量性状遗传等的影响，能够客观地提示供试材料之间DNA的差异，因而是一种理想和有效的分子生物学技术；⑨RAPD产物经克隆和序列分析后，可作为RFLP和原位杂交的探针，也能够转变成为利用经典PCR技术的分子标记，如序列标记位点(sequence tagged site, STS)、序列特征化扩增区域(sequence characterized amplified region, SCAR)等。

  2.RAPD标记技术的缺点  RAPD技术的局限性首先表现在RAPD标记在绝大多数情况下是显性标记，只有在极少数情况下才表现为共显性标记(待扩增的 DNA的变异如发生在引物结合位点为显性标记，发生在扩增区域则为共显性标记)。RAPD标记不能区别显性纯合基因型与杂合基因型。克服RAPD技术这一缺陷的方法是将RAPD标记转化为其他共显性标记。例如，将RAPD检测中出现的特异带克隆或重扩增用作探针，进行分子杂交，将RAPD标记转化为RFLP标记。

其次是RAPD技术的稳定性。RAPD技术是以PCR反应为基础的，因此对反应条件极为敏感，反应条件的细微变化可能会影响到扩增结果的重复性。然而只要保持实验操作的稳定性和一致性，RAPD的扩增结果还是不难重复的。此外，在实验结果的分析中，尽可能分析那些重复性好的谱带。将RAPD标记转化为其他分子标记也是克服RAPD技术稳定性差的方法之一。例如，将RAPD标记转化为 SCAR(sequence characterized amplified regions)。SCAR技术是将RAPD扩增的特异片段进行克隆和测序，根据两端的序列，合成较长的引物对，进行特异PCR扩增。SCAR技术只扩增特定DNA区域。因此。可克服RAPD技术稳定性差的缺点。

此外，也可将RAPD标记转化为RFLP标记。除此以外，RAPD技术通用性差。不同物种RAPD反应不同，这就要求在实际操作中，根据实际情况，在借鉴其他相近物种RAPD反应条件的基础上，建立适于本物种的RAPD反应条件。只要某一物种的RAPD反应条件一旦建立，该物种的RAPD操作将变得简便、快速。

三、RAPD技术的应用

与其他分子标记技术相比，RAPD技术具有简单方便、快捷、实验成本低且无需知道目标序列的有关信息等特点，一经问世，就被许多实验室广泛应用。这项技术不仅可用于核心种质资源的保存、实验动物种质资源亲缘关系研究，而且也为品种(品系)鉴定、构建遗传图谱等研究提供了一种十分有用的工具。

1.核心种质资源的保存  种质资源的收集和保存是遗传育种工作的基础。但遗传资源的长期保存需要消耗巨大的人力、物力。为了尽可能降低消耗，人们提出了利用“核心种质”来长期保存种质资源，这样在保存了尽可能多的遗传变异的基础上，又可减少保存的样品数目，大大降低所需费用。RAPD技术反映了遗传物质 DNA的变异，因此它为筛选“核心种质”提供了一个有利工具。常青等对太湖猪的保种研究采用RAPD技术确定核心群体，并建议对亲缘关系较近的类群可合并保护，减少保种目标的不必要重复及节约保种费用，在不丧失太湖猪遗传特性的前提下，开展不同类群间基因的交流，以增加太湖猪的多样性。

2.种质资源遗传亲缘关系研究  种质资源遗传亲缘关系研究是动物育种工作的重要组成部分，它可以为亲本选配提供依据。RAPD技术从DNA分子水平反映了基因组的多态性，因而更能准确揭示个体间的差异和物种的相关性。一般可以根据各品种指纹图谱的差异程度，判断品种间亲缘关系的远近，通过测量品种之间的遗传距离，进行系谱分析和分类研究。李霞等应用经过筛选的29条随机引物对剑尾鱼的第19代近交系12尾剑尾鱼个体基因组DNA片段进行RAPD扩增，计算近交系个体间的相似系数及遗传距离，分析近交系剑尾鱼的遗传纯度，以指导剑尾鱼实验动物标准化的培育工作。任军等用RAPD技术检测了泰和冠朝猪、永丰藤田花猪、瑞金三花猪、兴国茶园猪、上犹花猪、万安花猪、乐安花猪等7个赣中南花猪地方类群基因组混合DNA的多态性，遗传距离指数显示泰和冠朝猪和瑞金三花猪亲缘关系最近，兴国茶园猪和乐安花猪遗传距离最远。

3.品种(品系)鉴定  品种鉴定对于保护新育成品种及育种家的权益具有重要意义。相对于形态标记、同工酶标记及RFLP(限制性片断长度多态性)标记， RAPD技术具有高度的个体特异性而且方法简便、迅速，因而被认为是动物品种评价中较好的方法，甚至有作为品种鉴定、品种注册的常规手段的趋势。由于品种之间存在基因型差异，在理论上一定有能够产生特征条带的引物，因此，只要有足够的引物进行筛选，就一定能确定某个品种在某个引物扩增下产生的特征带，以便在品种鉴定中发挥作用。

Venugopal等为了用RAPD法区分近交系BALB/c和SJL/J小鼠，从100个随机引物中筛选出36个引物，扩增出204条特异性带型，再用F1代(BACB/c×SJL/ J)×SJL/J回交，平均有5.6条带出现分离，这个结果表示，RAPD技术非常适合于品系的鉴别。崔淑芳等利用RAPD技术筛选出5条随机引物对NJS及其亲本小鼠的遗传结构进行分析，并对NJS小鼠个体之间的基因组DNA进行相似性分析。吴开平等运用40条引物对TA1、BALB/c、KM、NIH、SCID、T739、DBA/2、615、BALB/c- nu/nu等9个品系小鼠的DNA进行RAPD-PCR扩增，以琼脂糖凝胶电泳观察结果。40条引物中只筛选出2条多态性引物，其他38条引物扩增结果无品系间多态性。RAPD-PCR方法可以区分9个品系的小鼠，是一种适宜于小鼠的遗传检测方法。

邵伟娟等用RAPD技术分析宁夏和洞庭湖两个地区东方田鼠杂交子代，研究表明所有的东方田鼠均有相同的扩增片段出现，两个不同地区的亲代分别有特异性片段，亲代的DNA带型均在子代中找到。RAPD分析能在一定程度上反映出东方田鼠种的特性以及亚种的特性，从而在一定程度上指导东方田鼠的分类、繁育。

张世栋等用RAPD分析了山东家禽研究所3个SPF鸡品系F系、M系、B系以及对照纯系H系，基本反映了其真实的遗传关系，F系和M系同时由同一家育种公司引进，其遗传距离可能比较近，单独引进的B系则与其遗传距离比较远，这与引种情况是吻合的。同时也反映了国内引进的SPF鸡种源不一、遗传结构较为丰富的情况。

家兔的RAPD标记多态性丰富，RAPD技术能迅速而较准确地提供大量的遗传标记，将不同品系加以区分。陈民利等选用10个随机引物对3个实验兔品系共22个样本DNA样本进行RAPD扩增，可扩增出不同品系之间共有的条带和各自的特征条带，可将WHBE兔与日本大耳白兔和新西兰兔品系很好地区分开来。赵立虎等从7套共140个随机引物中筛选出10个多态性较高的引物用于新西兰白兔、青紫蓝兔和日本大耳白兔3个品系的RAPD鉴定。庞荣清等从25个随机引物中筛选出5个具有较高多态性的引物，分别对5个群体的80只家兔基因组DNA进行了RAPD-PCR扩增，得到了5个家兔群体之间的远近不同的进化亲缘关系和聚类结果。Soto等利用RAPD技术从31个引物中选用8个多态性好的引物用于Volcano兔的遗传分析。

4.构建遗传图谱  遗传图谱是遗传研究的重要内容，也是动物遗传育种的依据。分子标记出现以前，形态标记、生化标记和传统的细胞遗传学方法已取得一定的进展。但由于标记数目少和工作量大等困难，使大多数动物的遗传图谱构建进展缓慢。RAPD等分子标记的出现和发展极大地推动了动物的遗传图谱的构建。 RAPD技术应用于遗传作图，不需要预先克隆标记或进行序列分析，而是直接完成多态性DNA标记的寻找，并同时完成对这些标记的遗传作图。这使得遗传作图变得容易且又快速方便。Woodward等用RAPD构建了小鼠遗传图谱，他用481种10碱基随机引物对C57BL/6和DBA/2J小鼠基因组进行扩增，检测到95个多态性位点，用B×D育成重组近交系方法将75个位点定位到染色体上。Welsh等也用随机引物对B×D重组近交系小鼠进行扩增，根据其中相互分离的多态性所占比例即为多态性基因连锁的一个指征。通过以上几项研究可以看出，利用RAPD可以构建实验动物分子遗传连锁图谱。Wardell等在研究C3H/HeJ(C3H/HeJ×SJL/J)F1小鼠时，发现14个雄性小鼠都出现了9个RAPD标记，显示出该标记为Y染色体连锁标记。Wardell等在研究中还发现9个标记中的4个标记为M.m.musculus和M.m.domesticus小鼠Y染色体共有；另有4个标记为M.m.musculus特有；还有一个标记为M.m.domesticus特有。国内张文艳等也发现了小鼠与性别相关RAPD标记。Cheah用10碱基随机引物对A×B和BA(A/J和C57BL/6)F1代小鼠PCR扩增，发现17种变异(扩增带)，再用B×D、N×SM F1代及20个近交系小鼠研究，确定17个位点位于12号染色体上。Welsh等利用RAPD技术构建了小鼠C57BL/6J×DBA/ZJ重组近交系个体及亲本基因组指纹图谱。他们用一个引物Kpn-R定位了4个多态性位点，另一个引物Kpn-R在两亲本间用RAPD检测出Kpn-360、Kpn-310、Kpn-235、Kpn-175、Kpn-185和Kpn-115 6条多态性DNA片段，其中Kpn-175和Kpn-185两个片段在重组近交系后代个体中表现为同一位点的长度多态性，其余表现为条带有无的多态性，除Kpn-360同原已建立的遗传图谱中的DNA标记未表现出紧密连锁外，其余的经统计分析都定位于图谱上。

连锁遗传图谱可以为育种工作者提供关于某个物种的完整而又详细的基本资料，很方便地对感兴趣的基因进行定位，并发现与该基因紧密连锁的分子标记，从而使选育工作目的性更强，有效性更高。但利用传统的形态学和生化标记方法很难构建高质量高密度的连锁图谱。因为这些标记数量少，不能全面反映生物基因组的全部情况，局限性很大；同时由于这些标记是基因的表达产物，易受内外各种环境因素的影响，可靠性不高。RFLP技术出现以后，这项工作才取得了很大的进展。但由于RFLP技术要求高、费用大，较难普遍推广，而RAPD技术正好弥补了这种不足。由于每个随机放大的多态性DNA片段可以作为分子图谱中的一个位点，大量的RAPD位点即可以使原有的根据形态学性状构建的遗传图谱或根据 RFLP构造的分子遗传图谱变得更加饱和，加大定位基因的密度，也可以单独构建连锁图。

5.标记辅助育种  遗传育种学家早就在理论上提出利用遗传标记加速育种进程。因为在实验动物品种遗传改良中，有些性状早期无法看出来，如果能够找到某一或某些重要性状基因的连锁位点，可以实现早期鉴定，大大加速异源目标基因的转移与利用。长期以来，人们多采用基于形态性状的标记，投入的人力、物力非常大，却往往取得事倍功半的效果。这是因为要找到与目标性状相关的遗传标记实际是很困难的。RAPD技术可以利用一系列引物对整个基因组DNA进行多态性检测分析，能在一次反应中检测基因组的多个位点，因而它可快速检测出两组 DNA样品间的多态性差异，得到与差异区域连锁的DNA标记。因此，利用RAPD可定位某一特定DNA区域的特定基因，也可为RFLP连锁图上的某一区域增加新的DNA标记。通过分析与目标基因紧密连锁的分子标记来判断目标基因是否存在，这种“标记间接选择”方法不受其他基因效应和环境因素的影响，结果较可靠，同时可在早期进行选择，从而大大缩短育种周期，提高选择效率。

四、展望

尽管RAPD技术有其自身的局限性，但是由于该技术具有简便、快速、准确以及成本相对较低等特点，RAPD还可以与RFLP相结合，由于RAPD标记不干扰 RFLP标记，因而可以加速遗传图谱的制作，同时RAPD技术大大加速了动植物遗传育种的进程。RAPD技术在生物学研究中还有很多应用，如种质资源、品种鉴别等，它还可以用于基因定位、基因表达、遗传质量监测、杂种优势的鉴定、系统发育以及突变体检测等与遗传育种有关的领域。可以断言，RAPD技术作为一种非常有效的分子标记在直接揭示生命奥秘的活动中将发挥愈来愈重要的作用，将会成为众多分子标记技术中走向普及的先锋技术，将会在实验动物的遗传育种研究中得到愈来愈广泛的应用，从而真正用于育种实践，大大提高育种效率。