摘要：2型糖尿病（T2D）以高血糖为主要病因，影响中枢神经系统，导致认知功能损害，是人类某些神经退行性疾病的主要标志。斑马鱼作为学习和记忆实验研究的一种有前途的模型生物，越来越受到人们的欢迎。本研究旨在探讨高糖诱导的高血糖或T2D对斑马鱼学习记忆的影响。在对成年斑马鱼进行蔗糖溶液存活研究后，将成年斑马鱼浸泡在83.25 mM蔗糖溶液中14天，可诱发高血糖症。实验动物分为2组，对照组和蔗糖组。之后，使用T-迷宫测试和空间学习测试对两组的学习和记忆表现进行评估，在两个实验中，斑马鱼被要求将一个可见的线索与食物奖赏联系起来，而不考虑这个配对的位置，或者将食物奖励的空间位置与迷宫内的线索相关联。高蔗糖诱导的高血糖组产生认知功能减弱，即简单的联想和空间学习能力，因为显示花费在靶臂或靶区停留的时间较少，靶臂或靶区的访问频率以及在实验装置中的总访问次数较低。总的来说，我们的结果证实了在一个陌生的环境，高蔗糖诱导斑马鱼的高血糖正影响它们的认知能力。这些结果进一步强化了这样一种观点，即使用现有的遗传工具可以进一步分析这种复杂的认知能力。

关键词：2型糖尿病  斑马鱼 认知 记忆  T-迷宫测试  空间学习测验

简介：2型糖尿病（T2D）是一种代谢紊乱，主要通过降低胰岛素敏感性和高血糖水平（即高血糖症）来识别。 它是全世界死亡的重要原因之一。慢性血糖升高是T2D的主要生化诊断指标。它的发生是由于胰岛素的分泌或功能丧失，胰岛素是一种促进葡萄糖从血液转运到细胞的激素。 如今，血糖水平的升高（即高血糖症）也会影响高度复杂的大脑活动，例如个人的学习和记忆。长期以来，斑马鱼一直是发育生物学研究的首选物种之一。近来，斑马鱼的使用在神经行为研究中呈指数级增长。由于其体积小（成年阶段长4厘米）、繁殖力高、多产（每雌产卵200枚）、成本低、易于维护、发育迅速、胚胎期透明等优点，已成为一种重要的模式生物。此外，这种简单脊椎动物的神经化学特性和大脑的基本布局几乎与包括哺乳动物在内的高等脊椎动物相似。

尽管在学习和记忆领域已有多年的成功研究，但在哺乳动物的不同神经行为和其他疾病中，如此复杂的脑机制仍有待进一步研究。为此，斑马鱼由于其潜在的转化相关性（即与哺乳动物基因相似的高核苷酸序列同源性和功能相似性）而成为了很好的模型。已经对斑马鱼的正常学习和行为记忆做了大量的研究。然而，高血糖对斑马鱼学习记忆能力的影响尚未见文献报道。因此，在本研究中，我们试图通过在T-plus迷宫测试和空间学习测试中手动记录行为，来量化成年斑马鱼高血糖模型的学习和记忆表现。T-plus迷宫试验和空间学习试验已经被用于啮齿动物的学习和记忆研究。这些测试利用斑马鱼的非空间联想和空间学习能力，分别将视觉线索与食物奖励、迷宫内或迷宫外线索联系起来。空间学习可以定义为生物体通过获取外部环境中空间线索之间的动态关系来建立空间地图的过程。先前的一些研究已经证明了正常成年斑马鱼的简单非空间学习和空间学习，并通过分析在目标臂或区域内的时间、目标臂或区域访问的频率和手臂访问的总次数来表征学习和记忆性能。在这项研究中，我们根据简单的联想学习任务和空间学习任务训练高血糖斑马鱼，以测试高血糖引起的斑马鱼的学习和记忆性能。

动物：实验使用了两个性别的野生型成年斑马鱼品系（6-10月龄）。鱼在过滤后的水中饲喂，室温和水温均保持在约28°C。在12-12小时的明暗循环中，由天花板和壁挂式管灯（直接放置在水箱上方）提供照明。每天两次给鱼喂食四片薄片状食物。

诱发高血糖：

通过存活研究确定，将15只成年动物的组置于28℃的5升水容器中，每个容器包含不同的蔗糖溶液，即27.75mM，55.50mM和83.25mM。在接下来的14天里，这些鱼保持在相同的条件下。在实验过程中，为了防止溶液中蔗糖浓度的进一步变化，鱼没有被喂食。. 对照组动物也在5升的容器中饲喂，与蔗糖处理组的时间和条件相同。根据上述研究，选择了83.25mM蔗糖溶液，因为其血糖水平与诱导稳定高血糖的水平相近，然后将每组10只成年动物放在83.25mM蔗糖溶液的7升水槽中，并在室温下饲养14天，以诱导稳定的高血糖。

T-迷宫测试：

所使用的测试设备由四臂，T形透明玻璃迷宫组成，与之前的其他实验相同。迷宫的四个臂（长35厘米，宽11厘米，高20厘米）通过一个正方形（11厘米×11厘米）相互连接，在这个正方形里可以放下一个启动盒，通过抬起启动盒就可以进入。T-plus迷宫被放置在一个大的透明玻璃水箱（长86厘米，宽86厘米，高20厘米）中，里面装满水，温度由四个对称定位的水族箱恒温器控制，从而帮助我们保持迷宫中恒定的水温。整个装置被放置在一个旋转的圆形平台上，这样我们就可以很容易地按照试验的要求定位迷宫。

空间学习测验：

所用的试验装置由一个透明的方形开放式玻璃罐（长80cm，宽80cm，高20cm）和四个透明的刺激罐（长26cm，宽15cm，高10cm）组成，罐的每一侧都与角落等距。方形起始箱（长10厘米，宽10厘米，高10厘米）也放置在水箱的中心，用于将鱼转移到行为水箱中。刺激池和试验池的水位相等，温度由四个对称放置的水族馆恒温器保持在28摄氏度，从而帮助我们保持仪器中的恒定水温。整个测试分四个阶段进行：习惯，训练，探究和行为量化。

结果：诱发高血糖

我们的研究结果表明，与对照组动物相比，在试验的第14天之前，将斑马鱼饲喂在4％以下的不同蔗糖溶液中会引起血糖水平的升高。因此，我们选择了3种不同的蔗糖浓度（低于4%的蔗糖溶液），即27.75mM、55.50mM和83.25mM，并在14天内以不同的固定间隔检查血糖水平。为了验证不同蔗糖浓度处理对斑马鱼血糖的影响，我们对数据进行了单因素方差分析和双向方差分析，发现83.25mM的蔗糖浓度是诱导斑马鱼稳定高血糖的具有统计学意义的浓度。此外，蔗糖浓度和天数对血糖水平的影响也非常显著。这些数据表明在斑马鱼中可以诱导和维持高血糖。

图1、不同浓度（27.75mM、55.50mM和83.25mM）蔗糖处理14d对斑马鱼血糖水平的影响（n = 3）

T迷宫试验：

首先，我们在简单联想学习任务的训练阶段（第一次和最后一次试验）和探索试验（提示卡和无提示卡）中，我们检查了高血糖鱼在含有食物奖励的目标手臂上所花的时间百分比。观察到对照鱼和高血糖鱼对目标臂均表现出一定的偏爱。 其背后的原因可能是因为目标臂是唯一的食物存放地点，因此斑马鱼可能实际上在这里花费了更多的时间来食用食物。。 此外，我们发现，与对照鱼相比，高血糖鱼在训练和探究试验期间在目标手臂上花费的时间更少。另外，重要的是，发现与第一次训练试验和带提示卡的探究试验相比，随着试验次数的增加，即在最后一次训练试验和没有提示卡的探究试验中，高血糖鱼花费的时间减少了。

空间学习测验：通过本实验，我们首先测试了正常斑马鱼和高血糖斑马鱼在训练中的表现。这里我们报告第一次和最后一次（第20次）试验的结果。配对和不配对训练组中的鱼都更喜欢留在目标区域，而目标区域包含刺激鱼。在第一次试验中，配对组和未配对组在靶区的单位面积上花费的时间百分比没有显著差异。然而，在第20次试验中，配对组和未配对组在靶区的时间百分比有显著差异。这些结果表明，在整个训练过程中，所有鱼类都始终保持与刺激鱼类保持密切联系的动机，这一发现与先前报道的斑马鱼强烈的浅滩化趋势相符。

结论：总的来说T2D可导致认知障碍，例如学习和记忆能力下降，实验结果证实了高糖陌生环境诱导高血糖斑马鱼并影响了斑马鱼的认知能力，并且高血糖与认知能力之间存在一定的关系。高血糖斑马鱼的学习记忆能力与T2D显著相关。有了这些信息，可以进一步阐明参与神经退行性变的基因、蛋白因子和通路，从而解释或发现其在T2D中的作用机制，从而对T2D有一定的新的认识，也为今后T2D患者的治疗提供了新的思路。

原文出自：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2666396120300121