摘要：哮喘是复杂的基因与环境相互作用的结果。 探索哮喘不同阶段的异质性有助于我们了解哮喘的发病机理和开发新的治疗策略，特别是重症患者。目的：这项研究旨在进一步了解急性和慢性哮喘的表现与各种内型之间的关系，并探讨肺部炎症的严重程度，细胞类型，细胞因子/趋化因子的差异以及FIP-fve的作用。

材料和方法：采用急性和慢性OVA致敏小鼠哮喘模型，使用了FIP-fve来评估对这两个模型的影响，检测BALF细胞因子/趋化因子。结果：十七种细胞因子/趋化因子在慢性期的分泌高于急性期。无论在急性期还是慢性期，FIP-fve治疗组均降低了气道高反应性，气道炎性细胞浸润，Th2细胞分泌细胞因子，趋化因子以及TNF-α，IL-8，IL-17，CXCL-1 ，CXCL-10，CCL-17和CCL-22，同时发现Treg细胞因子IL-10明显升高。PCA（主成分分析）还用于比较统计数据和实验室数据，以发现不同阶段以及FIP-fve治疗后的重要生物标志物。结论：在哮喘过程的不同阶段，存在许多不同的免疫反应。 在适当的时候进行药物治疗可能有助于减轻哮喘的恶化。

关键词：急性 慢性 哮喘细胞因子 趋化因子

简介：哮喘是一种慢性炎症性气道疾病，严重哮喘发作是致命的。哮喘是一种具有慢性炎症的复杂呼吸系统疾病。 病理变化包括急性炎症期肺嗜酸性粒细胞（浸润，粘膜水肿，粘液分泌过多和气道过度反应。在长期哮喘或严重哮喘状态下，气道杯状细胞、平滑肌组织、中性粒细胞浸润和血管生成加速。早期研究发现支气管肺泡灌洗液（BALF）和肺分泌物中的细胞因子和趋化因子可以调节炎症。哮喘患者的呼吸道中有很多T细胞浸润。 此外，先前的研究还表明，IL-12有助于CD4 + T细胞分化Th1细胞，而IL-4可以诱导Th2细胞分化。Th1细胞可以产生IL-2和IFN-γ（干扰素-γ），这对于防御至关重要，而Th2细胞可以产生IL-4，IL-5，IL-6，IL-9，IL-13， 与过敏性炎症机制有关。有研究表明Th1细胞和Th2细胞产生的细胞因子具有拮抗作用。这些反应通常由分泌IL10的调节性T细胞抑制，并可能在维持气道耐受性中发挥重要作用，但转化生长因子β的作用更为复杂，并有免疫抑制和气道重构的证据。最新研究指出，哮喘是复杂的基因与环境相互作用的结果，在临床表现，气道炎症和重塑的类型和强度上存在异质性。探索哮喘不同阶段的异质性有助于我们了解疾病的发病机理和开发新的治疗策略，特别是在严重疾病的情况下。根据最近的研究，哮喘免疫学的异质性可分为嗜酸性（过敏性和非过敏性），非嗜酸性（嗜中性1型和17型以及多核粒细胞性）和混合性粒细胞性炎症。在嗜酸性粒细胞过敏性哮喘中，发生2-型高气道炎症，变应原致敏后，适应性Th2细胞产生IL-5，IL-4和IL-13。此外，驱动嗜酸性粒细胞炎症和非嗜酸性粒细胞哮喘的变应性和非变应性机制可能会同时发生，导致混合的粒细胞性炎症或炎症谱随时间变化。有许多临床和实验研究表明，过敏性哮喘比以前认为的更加异质和复杂。先前在对哮喘Th17和Th22细胞因子的研究中，新兴的Th22免疫细胞分泌的细胞因子IL-17和IL-22对慢性哮喘和炎性疾病有一定影响。当Th22细胞不起作用时，过度炎症会加剧慢性和过敏性炎症疾病。免疫细胞刺激Th22细胞及其分泌的细胞因子IL-22和TGF-β修复炎症引起的损伤。然而，当炎症变为慢性时，Th22细胞，IL-22和TGF-β细胞因子继续异常分泌。 Th22和IL-22的过度分泌使过敏性炎症更加严重。已在牛皮癣和特应性湿疹患者的血液测试中得到证明。先前的研究揭示了IL-22可以抑制IFN-γ介导的肺部炎症，并且先前的动物研究还显示，在没有IL-17的情况下，IL-22可以作为抗炎细胞因子，而在存在IL-17的情况下 IL-22有助于炎症细胞的募集。

另一个重要的细胞因子TGF-β是参与哮喘肺组织重塑的主要介质之一。在哮喘气道中，TGF-β可诱导气道上皮细胞产生抗凋亡或凋亡的作用，当气道上皮细胞因持续接触过敏原和促炎介质时，上皮细胞就会发生脱落。当发生慢性炎症时，TGF-β分泌增加加重气道重塑现象。TGF-β、IL-22、IFN-γ和IL-17在急慢性气道炎症中的作用有待进一步研究。用于治疗严重哮喘的新生物疗法以及生物标志物的发展为表型特异性干预措施和实现更个性化治疗提供了机会。 因此，本研究的另一个重点是真菌免疫调节肽-fve（FIP-fve），它是一种免疫调节蛋白。一些研究报告说，从蘑菇中提取的FIP-fve可以引起HPBMC（人外周血单核细胞）产生IFN-γ。 FIP-fve可能在调节哮喘中起关键作用。根据过敏原刺激的剂量和持续时间，哮喘具有不同的内型和肺部炎症的差异。在这项研究中，我们想进一步了解急性哮喘和慢性哮喘表现与各种内型之间的关系，并探讨肺部炎症的严重程度，细胞类型，细胞因子/趋化因子的差异以及FIP-fve的作用。

动物：雌性BALB / c小鼠，6周龄，为高IgE免疫应答者，无卵白蛋白饮食，自由饮水。

过敏原免疫/激发方案：急性期的实验设计：致敏方案如下：小鼠在第1、2、3天腹腔注射50μg 的OVA与5x氢氧化铝，在第14、17、21、24和27天鼻内接受50μl的5％的OVA  。对照组腹腔注射生理盐水加氢氧化铝。在乙酰胆碱激发后28天，测定所有实验组的气道高反应性（AHR），并处死小鼠。

图1、急性和慢性OVA致敏方案 雌性小鼠在急性期（图1a）或慢性期（图1b）腹腔注射50μg与氢氧化铝混合的OVA，鼻内滴入100μl的5％OVA 。在乙酰甲胆碱激发后的第28天或第76天，在所有实验组中均测定气道AHR。为评价FIP-fve对减轻小鼠肺部炎症和改变免疫微环境的作用，致敏小鼠给予FIP-fve。治疗组灌胃给予FIP-fve（200μg/只/天）。

为了评估FIP-fve对减少肺部炎症和改变免疫微环境的作用，致敏小鼠给予FIP-fve。 在第14-27天，随机治疗组每天灌胃给予FIP-fve（200μg/只/天）。 作为预防手段，在第1-14天给予小鼠FIP-fve。

慢性期实验设计：致敏方案如下：在第1、2、3天小鼠腹腔注射50μg卵白蛋白（OVA）和氢氧化铝，并在第14、17、21、24、27、60、69、71、73、74和75天鼻内滴入50μl的5%卵白蛋白（OVA）。对照组腹腔注射生理盐水和氢氧化铝。

慢性期FIP-fve治疗：FIP-fve组小鼠给予FIP-fve。预处理组在第1-14天和第45-60天接受FIP-fve治疗。后续组在第14-28天和第60-75天接受FIP-fve治疗。 在乙酰甲胆碱激发后第76天，所有实验组均测定AHR，并处死小鼠。

AHR-气道阻力测定：在最后一次I.N.之后24小时后，使用FinePointe RC系统测量清醒和自发呼吸动物的气道反应性。测量乙酰胆碱的Penh，小鼠支气管收缩的有效指标，可用于测定AHR。将浓度增加（2.5–50 mg/ml）的气雾化乙酰甲胆碱通过腔体入口雾化3分钟。支气管收缩会改变呼吸方式，早期和晚期呼气时间（暂停）以及在Penh的改变是呼吸时间改变以及呼气时间延长的结果。此外，气道收缩与鼻腔流量不同步地增加了胸腔流量，从而导致了箱内压力信号的增加。Penh是一个参数，它反映了由于支气管收缩而导致的所测腔体压力信号的波形变化。在获取读数之前，通过向主腔室快速注入150μL的空气对腔体进行校准。

血清特异性IgE/IgG2a/IgG1水平测定：测完气道阻力后，处死小鼠，然后通过心脏穿刺进行取血。然后在4°C，6000 rpm下离心5分钟，取血清。将血清分成三等份，并保存在-70°C下，进行细胞因子和抗体水平分析。间接ELISA用于确定IgE / IgG2a / IgG1血清抗体滴度。

支气管肺泡灌洗液收集和细胞计数：测量AHR后，使用CO2对小鼠进行安乐死。 用1 ml生理盐水收集肺灌洗液用于BALF。用血细胞仪检测BALF的细胞数。

结果：急性期与慢性期AHR与FIP-fve效应的差异：变应原成功诱导了急慢性哮喘动物模型。急性期和慢性期小鼠通过0、5、10mg乙酰胆碱致敏均无显著性差异。在急性期和慢性期小鼠通过20mg乙酰胆碱致敏有显著性差异。慢性期AHR值较高。此外，用FIP-fve治疗的致敏小鼠不仅在急性期，而且在慢性期也有改善。

图2、急性期与慢性期AHR与FIP-fve效应的差异。

血清OVA特异性抗体在急性和慢性期的差异和FIP-fve效应：过敏性疾病的一个特征是血清中高浓度的IgE。根据我们的结果，在这两个用OVA致敏且未给予FIP-fve的模型中，血清中IgE的表达均较高。慢性期IgE水平最高。然而，FIP-fve治疗的致敏小鼠不仅在急性期，而且在慢性期也降低了IgE水平。此外，IgG1和IgG2a水平证实了Th2和Th1的反应。结果显示在卵白蛋白致敏/激发期间接受FIP-fve治疗的组在急性期和慢性期血清IgG2a水平显著升高，而在FIP-fve组中IgG1降低。

肺部浸润细胞急性和慢性期的差异和FIP-fve效应：急性和慢性哮喘阶段的标志是炎性细胞（如嗜酸性粒细胞和中性粒细胞）渗透到肺中。BALF用于评估肺的细胞浸润，并计数嗜酸性粒细胞和中性粒细胞。结果显示，在急性和慢性期OVA致敏小鼠的肺部浸润性炎症细胞显著增加。急性期嗜酸性粒细胞明显高于其他期。慢性期中性粒细胞明显高于其他阶段。FIP-fve治疗组肺浸润细胞明显减少，不仅嗜酸性粒细胞减少，而且急性期和慢性期的中性粒细胞也明显减少。

肺炎症急慢性期的差异及FIP-fve效应：在OVA致敏的小鼠组中，气道炎症非常严重，尤其是在慢性阶段。 FIP-fve治疗后，不仅在急性阶段，而且在慢性阶段的炎症明显减少。 气道重塑也得到改善。

图3、肺炎症急慢性期的差异及FIP-fve效应。

结论：在哮喘的不同阶段，存在许多不同的免疫反应。 在适当的时候进行药物治疗，可能会预防哮喘症状恶化。 此外，在不同时间点细胞因子浓度的变化需要进一步研究。 但是，FIP-fve不仅可以在急性阶段而且可以在慢性阶段通过免疫调节来改善哮喘。 因此，FIP-fve可能是替代疗法，可用于治疗过敏性气道疾病，例如哮喘。

 原文出自：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1684118220301638