小鼠研究院丨诺奖级CRISPR在基因编辑动物中的应用
2020年诺贝尔化学奖于10月7日授予Emmanuelle Charpentier和Jennifer A. Doudna，获奖原因：开发了一种基因组编辑方法[1]。这项技术早在2015年的时候被评为国际著名的生命科学突破奖[2]，该技术对生命科学产生了革命性的影响，开发新的遗传疾病治疗的方法，新的癌症疗法，为生物技术提供了无限可能。诺贝尔奖对于基因编辑技术的认可，也是揭示了这一技术的影响力和重要性。
CRISPR/Cas系统为目前发现存在于多数细菌与绝大多数的古菌中的一种后天免疫系统，以消灭外来的质粒或者噬菌体，并在自身基因组中留下外来基因片段作为“记忆”[3, 4]。目前这一发现有3种不同类型的CRISPR系统，其中以Cas9蛋白以及向导RNA（gRNA）为核心的组成较为简单，且目前使用最为广泛，CRISPR/Cas系统应用于哺乳类细胞及斑马鱼等的基因剪辑，通过遗传工程的改造获得各种不同的模式生物[5]。
早在1987年的时候，石野良纯就曾发现过大肠杆菌里的CRISPR序列，但是当时并未有详细的研究[6]。
2000年，就读于University of Alicante的Francisco Mojica博士同样发现了古细菌的DNA序列中存在30个碱基大小且不断重复的“回文”片段，Mojica博士将其命名为短间隔重复序列（Short Regularly Spaced Repeats，SRSR），并于2002年为其更名为常间回文重复序列丛集/常间回文重复序列丛集关联蛋白系统(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-associated proteins），简称CRISPR，继续研究了其他20多种微生物里也有类似CRISPR序列[7]。
2012年，Emmanuelle Charpentier教授与Jennifer Doudna教授对CRISPR序列的作用进一步地探究，并阐明了其机理[8]，确认了CRISPR-Cas9基因编辑系统能在DNA的特定的位置切开口子。Cas9蛋白具有核算内切酶的功能，它首先与一个sgRNA结合，PAM序列，在sgRNA序列的引导下结合到DNA靶标位置（靶标位置尊在PAM的结构序列），切割目标DNA双链，导致双链DNA断裂，并启动DNA损伤修复机制，将双链缺口闭合，从而实现了细胞中目标基因的敲除。如果在此基础上为细胞引入一个修复的模板质粒（供体DNA分子），细胞会按照提供的模板在修复过程中引入片段插入或者定点突变，从而实现基因的替换或者突变。
CRISPR基因编辑系统[8]
多位生物学家通过原核细胞或者体外试管实验方法推动CRISPR基因编辑前进的研究铺下坚实的理论基础。但是动物或者人类细胞结构和环境的复杂性远远高于原核或者古细菌，以及动物到人类的技术演进上将存在巨大瓶颈。
2013年，Broad研究所的张锋教授首次将Cas9技术应用到哺乳动物细胞内，建立小鼠的疾病模型[9]。CRISPR-Cas9技术的快速发展被视为分子生物学的一大奇迹，同样值得庆幸的是“肿瘤免疫疗法”在2013年被世界权威杂志《科学》（Science）列为年度“十大科学突破榜首”。CRISPR-Cas9技术定向敲除肿瘤免疫检查点分子或者通过快速简便的基因编辑，而被广泛应用于肿瘤治疗领域，显著降低了肿瘤免疫治疗的操作难度，同时也极大促进了肿瘤免疫治疗研究的发展。其在CAR-T、免疫检查点、抗体靶向疗法等主要肿瘤免疫疗法中得到广泛的应用。
同年，高翔教授团队基于10余年基因编辑经验的基础，成功在国内将Cas9技术首次应用于大小鼠以及其他哺乳动物，并将其编辑效率提升了10余倍，脱靶效应降低到最低，甚至检测不到[10]，成功开发中国首个CKO大鼠、CKO小鼠[11]，且开发全球首例Cas9 KO犬[12]和全球首例Cas9 KO猴[13]，打开Cas9技术在动物基因编辑模型上的途径。同时，利用Cas9技术自主开发了人源化模型（免疫检查点、免疫重建）、免疫缺陷模型以及其他的肿瘤免疫模型。
价格低、交付周期短的敲除小鼠模型一直是市场的迫切需求。大规模制备小鼠模型建设斑点鼠现货小鼠产品资源库是实现这一目标的最佳途径。集萃药康凭借着多年技术积累和重点技术攻关，摸索出在稳定性及成本控制上都具有明显优势的大规模小鼠模型制作技术路线，自2018年10月份，江苏集萃药康生物科技有限公司宣布发起“斑点鼠计划”，计划旨在基于CRISPR/Cas9技术在2022年内完成所有蛋白编码基因的cKO/KO小鼠品系创制，实现小鼠基因敲除模型的产品化。基因敲除小鼠可分全身性基因敲除（Gene Knockout，KO ）和条件性基因敲除（Conditional Gene Knockout，cKO）两种，KO模型是传统的常用的基因功能和药物研发模型，cKO模型相较于KO模型可以提供细节更为丰富、证据更为确凿精准的研究数据，近年来在敲除小鼠模型中的占比呈急速增长趋势。截至目前为止，集萃药康基于基因编辑技术CRISPR/Cas9技术建立14000余小鼠品系，其中12000余斑点鼠品系，部分品系处于活体现鼠状态，我们已逐渐实现小鼠基因敲除模型的产品化。目前斑点鼠计划资源库已涵盖了肿瘤、代谢、免疫、发育、DNA及蛋白修饰等热门研究方向的基因。
References
[1] The Nobel Prize in Chemistry 2020, Retrieved October 7, fromhttps://www.nobelprize.org/prizes/chemistry.
[2] Recipients Of The 2015 Breakthrough Prizes In Fundamental Physics And Life Sciences Announced.
[3] Westra ER, Swarts DC, Staals RH, Jore MM, Brouns SJ, van der Oost J. The CRISPRs, they are a-changin': how prokaryotes generate adaptive immunity. Annu Rev Genet. 2012, 46: 311-339.
[4] Marraffini LA, Sontheimer EJ. CRISPR interference: RNA-directed adaptive immunity in bacteria and archaea. Nat Rev Genet. February 2010, 11 (3): 181-190.
[5] Mali P, Yang L, Esvelt KM, Aach J, Guell M, Dicarlo JE, Norville JE, Church GM. RNA-Guided Human Genome Engineering via Cas9. Science. 2013.
[6] Yoshizumi Ishino et al., (1987), Nucleotide Sequence of the iap Gene, Responsible for Alkaline Phosphatase Isozyme Conversion in Escherichia coli, and Identification of the Gene Product, Journal of Bacteriology, DOI: 10.1128/jb.169.12.5429-5433.1987.
[7] Eric S. Lander, (2016), The Heroes of CRISPR, Cell, DOI: 10.1016/j.cell.2015.12.041.
[8] Martin Jinek et al., (2012), A Programmable Dual-RNA-Guided DNA Endonuclease in Adaptive Bacterial Immunity, Science, DOI: 10.1126/science.1225829.
[9] Le Cong et al., (2013), Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems, Science, DOI: 10.1126/science.1231143.
[10] Bin Shen et al., (2014) Efficient genome modification by CRISPR-Cas9 nickase with minimal off-target effects, nature methods, doi:10.1038/nmeth.2857.
[11] Bin Shen et al., (2013) Generation of gene-modified mice via Cas9/RNA-mediated gene targeting, Cell Research, 23:720-723.
[12] Qingjian Zou et al., (2015) Generation of gene-target dogs using CRISPR/Cas9 system, Journal of Molecular Cell Biology, 7(6), 580-583.
[13] Yuyu Niu et al., (2014) Generation of Gene-Modified Cynomolgus Monkey via Cas9/RNA-Mediated Gene Targeting in One-Cell Embryos, Cell 156, 836-843.
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