在制定啮齿类实验动物的质量监测方案时，我们通常有三个可选方案：直接抽检、哨兵鼠监控及近些年兴起的排风口粉尘（EAD，Exhaust Air Dust）PCR监控。

在实际工作中，这三种方法通常会交叉使用，相互补充。本文就这三种方法进行分析，为机构微生物监测方案的制定提供参考意见。

直接抽检法

直接抽检法是最直接的微生物监控措施，国家标准中推荐的就是这种方法。

直接抽检法有两个显著的优势：

一是快速，无论哨兵鼠法还是EAD法都需要等待一段时间后才可以检测到动物感染或携带的病原体，而直接抽检法随时可以抽取动物群体中的任意个体进行检测；

二是准确，由于所抽检的就是待检动物本身，所以也是最能体现动物真实感染状况的方法。

在实际应用中却并非是随便抽检几只动物那么简单。首先要考虑的问题是抽检率，在国标GB 14922.2-2011规定的抽检率如下表所示。这是一个依据群体大小给出的宽泛检测数量约定，即少于100只的群体，抽检数量不少于5只，100-500只范围内抽检数量不少于10只，大于500只时抽检数量不少于20只。但实际应用上，这个规定的参考价值不大。

显然抽检率需要依据预估病原体感染率来定，病原体感染率不同所应抽检的动物数量也是不尽相同。在感染率低的情况下，必须抽检更多数量的动物才能检测到感染动物；而在感染率高的情况下，只要检测少量动物就可以检测到感染动物。

而独立通风笼盒（IVC和EVC）系统的广泛使用使得病原体传播效率比开放笼盒要低得多，这种情况下，就可能需要抽检更多动物才能检测到感染的动物。所以在实际制定监测方案时，这种方法仅在特定情况下才会使用，例如：抽检已经出现临床症状的动物、对新购入的动物进行直接抽检等。

脏垫料哨兵鼠法

脏垫料哨兵鼠法是指选择不携带监测方案中规定的病原体的动物，暴露于被监测动物使用过的脏垫料中一段时间，进而对这些哨兵动物进行检测，以了解被监测动物的病原体携带状况。 

显而易见，该法的优点是监控范围大，依据设定，一个笼盒的哨兵鼠可以同时监控十数笼甚至数十笼动物，这尤其有利于独立通风笼具系统内饲养动物的微生物监控。 

但脏垫料哨兵鼠法最大的问题在于其延迟性，大多病原的检出至少会延迟4周，在那些以一个季度为周期的方案中，延迟就达到三个月，在这段时间内，如果发生感染，将导致更大范围的扩散。

另外，哨兵鼠的暴露方法决定了其主要用来监控可以通过粪口传播方式感染的病原体，而无法监控通过空气传播的病原体。如仙台病毒和CARB都无法通过脏垫料哨兵鼠进行传播。亦有一些病原体，例如嗜肺巴斯德杆菌（现改名为Rodentibacter spp）因通过脏垫料的传播效率低下，而不适用于脏垫料哨兵鼠法监控。当群体中感染的动物数量较少的时候，脏垫料法也无法使哨兵鼠暴露于足够多的感染因子中，这时候也往往会无法检测到感染的存在。即便如此，考虑到其是最为经济的监控方法，目前在我国，哨兵鼠方案仍然是应用最多的设施微生物监控手段。

EAD PCR监测法

欧美近几年越来越多的单位验证和尝试用PCR方法检测笼架通风口粉尘以达到监测目的。此外也有一些笼具生产厂家可以额外在笼具出风口或初效过滤器处设置粉尘捕捉装置。

目前MHV、MPV、仙台病毒、嗜肺巴斯德杆菌、螺杆菌、鞭毛虫、蛲虫及螨虫等多种病原体都已证实可在EAD样本中检出，其时效性和检出率比脏垫料哨兵鼠也有显著提升，最快在暴露后一周就可检出，且在感染比率非常低（1/63）的情况下就可以成功检测到感染因子。另外，使用EAD进行PCR检测不需要额外使用或可以减少使用哨兵鼠，也是3R原则的体现。

当然，这也并不是说EAD的PCR检测就可以完全取代哨兵鼠，在使用这个方法前，我们还需要了解以下信息：

EAD样本能否成功检测到感染因子和笼盒、笼架设计关系密切，如果在设计中，从笼盒中排出的空气已经经过过滤，那在通风口主管道中通常是无法检测到目的病原的。所以，您的动物设施中使用的笼架是否可以采用这种办法进行检测，还需要和笼具供应商确认。 

此外，虽然已经有许多病原体都已经证实可以从EAD样本中检出，但是也有很多病原体，尚未证实可以检出，或其检测效果尚有争议（如，IDEXX的研究显示MNV不能有效从EAD样本中检出，但其他多个研究显示可以检出）。 

因为PCR方法的高敏感性，且其检测对象是核酸片段，所以在笼架通风管道清洗中未清除干净的核酸片段也可能被扩增出来。为防止类似情况造成不良影响，对于从EAD样本中检测出的阳性结果，我们需要在动物样本中进行验证性检测后才可确认动物是否真的有感染。

采用PCR检测时，所选择的检测实验室的专业性也至关重要，PCR方法敏感性高，在样本处理、实验过程中容易发生气溶胶污染，所以必须有可靠的质控体系对结果进行监控、确认。 

目前欧美多个实验室已将EDA样本的PCR检测作为哨兵鼠方案的补充或者替代方案，对设施动物微生物携带状况进行监测。

从上面的介绍可以看出，这三种方法各有优势，适用不同的场景。对此话题感兴趣的朋友，欢迎在本号留言分享你们的微生物监控经验。

参考文献：

1. Mailhiot D , Ostdiek A M , Luchins K R , et al. Comparing Mouse Health Monitoring Between Soiled-bedding Sentinel and Exhaust Air Dust Surveillance Programs[J]. Journal of the American Association for Laboratory Animal ence: JAALAS, 2019, 59(1).

2.  Miller M , Ritter, Bärbel, Zorn J , et al. Exhaust Air Dust Monitoring is Superior to Soiled Bedding Sentinels for the Detection of Pasteurella pneumotropica in Individually Ventilated Cage Systems[J]. Journal of the American Association for Laboratory Animal enceJaalas, 2016.

3. IDEXX, A Comprehensive Animal Health Monitoring Program

4. GB/T 14922.2-2011 实验动物 微生物等级及监测