目前还没有关于真正的有关新型冠状病毒 2(SARS-CoV-2) 在世界范围内感染和发病的可靠数据。 我们调查了在 2019 年 9 月至 2020 年 3 月间参加前瞻性肺癌筛查试验的 959 名无症状个体的血液样本中存在 SARS-CoV-2 受体结合域 (RBD) 特异性抗体，以跟踪意大利各地区病毒出现时间、频率、随时间和地理位置的变化。在 959 例样品中，111 例 (11.6%）检测到 SARS-CoV-2 RBD 特异性抗体，其中从 2019 年 9 月开始，14% 的 9 月样本抗体阳性，2020 年 2 月第二周> 30% 的样本抗体阳性，伦巴第地区（Lombardy）的抗体阳性比例最高 (53.2%）。 这项研究显示，在意大利第一个病人被确诊前几个月，SARS-CoV-2 已经在意大利的无症状个体中出现了意想不到的早期传播。 在意大利 COVID-19 爆发前在无症状人群中发现 SARS-CoV-2 抗体可能会重塑流行病的历史。    在 2019 年 12 月底，引发严重肺炎的新型严重急性呼吸综合征冠状病毒 2 (SARS-CoV-2) 在中国湖北武汉最先得到确认。COVID- 19 病毒性疾病在全世界迅速蔓延，世界卫生组织于 2020 年 3 月宣布进入大流行状态 (www.who.int)。 意大利前两例 COVID-19 疾病记录于 2020 年 1 月 30 日，当时来自中国的两名游客在罗马检测到 SARS-CoV-2 阳性。第一个经实验室确认的意大利 COVID-19 病例于 2020 年 2 月 20 日在伦巴第地区发现，一名 38 岁的男子，没有可能接触阳性病例的历史。 在几天内，在周围地区记录了更多的 COVID-19 和危重病人病例。不久，在意大利其他地区，主要是北部地区发现了一些病例。首先在伦巴第和威尼托的两个关键地区实施封城，3 月 8 日开始在区域乃至全国迅速实施封城措施。

鉴于第一个病例，有推测该病毒自 2020 年 1 月以来一直在意大利传播。 然而，迅速蔓延、大量病人需要住院治疗和在重症监护病房接受治疗以及大流行的持续时间表明，可推测病毒可能以症状较轻的形式到达意大利并在意大利传播已有几个月时间。

血清学检测可用于研究 SARS-CoV-2 感染导致的抗体反应，并评估其实际流行情况。COVID-19 患者的研究表明，几乎 100% 的重症病人在出现症状后的 13 天内会出现抗 SARS-CoV-2 的 IgG 或者 IgM 抗体反应。为了检验 “病毒在意大利早已存在” 的假设，我们用专有的 SARS-CoV-2 结合和中和抗体分析方法研究了样本库中一组 959 个无症状个体的血浆样本，分析了群体中 SARS-CoV-2 暴露的频率、时间和地理分布特征。该组人群于 2019 年 9 月至 2020 年 3 月通过 SMILE 试验 (肺流行病的筛查和多重干预 ；临床试验. gov 编号：NCT03654105) 注册，这是一项使用低剂量计算机断层扫描和血液生物标志物的前瞻性肺癌筛查研究，经我们的机构审查委员会和伦理委员会批准。所有符合条件的参与者都提供了书面知情同意。

检测方法采用实验室自研的受体结合区域（RBD）特异性酶联免疫吸附试验 (ELISA) 和基于 CPE 的活病毒微中和分析。（注意！这是这篇意大利论文在中国学者中最受质疑的地方，文末有详解）

总之，397 名患者（41.4%）是女性，63.2% 是 55-65 岁，76.8% 是现吸烟者，92.9% 吸烟⩾30 包 / 年。 总的来说，959 份血浆样本中有 111 份（11.6%）显示有 SARS-CoV-2RBD 特异性抗体 (IgM、IgG 或两者兼而有之)。 特别是在 97 例（10.1%）患者中检测到 IgM 抗体；在 16 例患者中发现 IgG 抗体（1.7%，部分兼有两种抗体）。所有患者在采集血样时均无症状。 表 1 显示了在意大利内根据样品采集时间划分的抗 SARS-CoV-2 RBD 抗体检测阳性分布。 在 2019 年 9 月至 10 月的前 2 个月，9 月采集的 162 分样本中有 23 份（14.2%) 显示有 IgG 或 IgM 抗体，10 月采集的 166 份样本中 27 份 (16.3%）患者样本显示 IgG 或 IgM 抗体阳性，或两者兼而有之。最早的阳性样本 (IgM - 阳性) 记录来自 9 月 3 日的威尼托 Veneto 地区，然后是 9 月 4 日来自 Emilia Romagna 的一例、Liguria 一例（9 月 5 日）、Lombardy 一例 (Milano 省；9 月 9 日) 和 Lazio 一例（罗马；9 月 11 日）。截止到 9 月底，23 个阳性样本中有 13 个（56.5%） 记录来自伦巴第，三个在威尼托，两个在皮埃蒙特，一个在 Emilia Romagna，Liguria，等等。

图 1 中的图表说明了 2019 年 9 月至 2020 年 2 月阳性样本比例随时间的变化。值得注意的是，两个抗 SARSCoV-2RBD 抗体阳性的峰值：第一个峰值开始于 9 月底，在 10 月的第二周和第三周分别达到 18% 和 17% 的 IgM 阳性占比。 第二峰值发生在 2020 年 2 月，第二周 Ig M 阳性病例占比超过 30%。 在这组 16 个阳性样本中，11 个（68.7%）来自伦巴第。

SMILE 研究最后一次志愿者招募在 3 月 10 日，补充表 S3 是 959 名招募志愿者和其中 111 名 SARS-CoV-2 RBD 抗体检测阳性样本在意大利境内分布情况与 3 月 10 日意大利确认 COVID-19 患者的分布情况相比结果。 这 959 名被招募的志愿者来自意大利所有地区，在 13 个地区都至少检测到一名 SARS-CoV2 阳性患者。 根据从意大利卫生部网站收集的数据，伦巴第是受这一流行病影响最严重的地区，10141 名被检测者中有 5791 名（57.1%）COVID-19 患者，对应研究中伦巴第招募的志愿者人数最多（491/959 ，占 51.2% ） 。而 111 例抗体阳性案例中伦巴第占 59 例（53.2%），其次是 Piedmont 和 Lazio(10 例），后略

用基于细胞病变效应 (CPE) 的活病毒微中和实验（生物安全二级实验室）对所有 111 个 SARSCoV-2 RBD 阳性样品进行了抗 SARS-CoV-2 功能性中和抗体 (NABS) 评估。在 111 例 SARS-CoV-2 RBD 阳性案例中，6 例在定性的 CPE 微中和试验中呈阳性，其中 10 月收集的样本有四个（7 日两个，8 日和 21 日各一个），11 月一个，2 月一个；其中三个阳性 NAB 样本来自隆巴迪，一个来自拉齐奥，一个来自托斯卡纳，一个来自 ValleD‘Aosta。 2019 年 10 月初的样本中存在功能性抗 SARS-CoV-2 中和抗体，进一步支持病毒早在 12 月之前已经在意大利，特别是在伦巴第地区的传播。

需要突出和讨论两个现象。 第一个问题是低估了案例的普遍性。地区和国家卫生当局在试图尽早查明病例和疑似病例、并追踪所有潜在接触者之后，很快放弃了这一企图，认为这是不可持续的，并将重点放在仅针对症状性病例的拭子和血清学确认。因此，对 COVID19 病例的总体估计被低估，并引入了选择偏差，高估了死亡率。 在 2020 年 2 月 22 日至 5 月 29 日期间， 对威尼托地区主要医院的 8285 名医护人员进行了 SARS-CoV-2 感染的检测。通过测量特异性抗体，观察到 4.6% 的总体流行率。 尽管在重症患者中 100% 可以检测到抗体，但是轻症患者患者的血清阳性率较低 (83%），无症状个体的阳性率最低 (58%）。5 月 25 到 7 月 15 日之间，意大利卫生部进行了一项大型 SARS-CoV-2 血清阳性研究，样本量达 64660 人，总体阳性率 2.5%，伦巴第地区达到 7.5%，Bergamo 省高达 24%.。由此推出实际接触病毒人数可能达到 150 万，大多数无症状，是官方报道数据 5 倍之多。

   第二个值得关注的是疫情的开始，这很可能是在第一个病例确诊之前，可能是在 2019 年最后一季度。 自 2019 年 11 月至 12 月以来，许多全科医生开始报告患有非典型双侧支气管炎的老年人和体弱者出现严重呼吸道症状的情况，在没有关于新病毒的消息的情况下，被归因于侵袭性的季节性流感。 在意大利北部两个最初封城的地区之一，对健康献血者中的 SARS-CoV-2 血清流行率进行了一项调查。在一组 300 个储存血浆样本中，2 月 12 日到 17 日之间的 5 个样本有抗 SARS-CoV-2 的中和抗体。 此外，SARS-CoV-2 基因组系统发育分析第一轮 COVID-19 爆发的 3 个伦巴第患者的病毒基因组毒株共同起源可追溯到几周前。这些证据表明意大利可能存在更早期的、未被注意到的病毒传播。    鉴于全世界症状性病例的迅速增加，更好地了解 COVID-19 的最初历史和流行病学可能有助于改进筛选策略， 并遏制可能的第二波大流行的影响。 环境监测的证据表明，2019 年底，SARS-CoV-2 已经在意大利北部流传。对 2019 年 10 月到 2020 年 2 月份采集的意大利北部 3 个城市地区（ (Milan/Lombardy,  Turin/Piedmont, and Bologna/Emilia Romagna)）40 份复合影响废水样本进行分子分析与 PCR 分析，其中 12 月 18 日在米兰和都灵的废水样本中检测出了 SARS-CoV-2 病毒 RNA。这研究同样提示了 SARS-CoV-2 已经在不同地区同时传播，跟我们的结论相符。

在国际层面上，一篇文章报道了 2019 年 12 月一例法国巴黎患者因咯血住院，没有病因诊断，对储存的鼻咽拭子的回顾性分子分析证实了 SARS-CoV-2 感染的诊断。来自哈佛大学的研究省略若干。

这些发现表明病毒可能在爆发时已经在多个国家传播。据我们所知，世界上任何国家都没有关于 SARS- CoV-2 的抗体反应的公布数据。我们的研究是在来自意大利所有地区的无症状个体的样本中进行的。在 13 个地区至少都检测到一个 SARS-CoV-2 阳性个体，伦巴第的数量最高，与国家调查的数据一致。

    第一批抗体阳性案例确定出现于 2019 年 9 月至 10 月间。2019 年 10 月采集的样本在基于 CPE 的微中和检测中检测到了具功能性的抗 SARS CoV-2 中和抗体。 鉴于感染和抗体合成之间的时间延迟，这些结果表明，该病毒在官方首例确认患者之前很早就在意大利传播，甚至比中国官方报道首例病例还早。

补充说明关于检测方法本研究使用的血清学检测是一种基于 SARS CoV-2 RBD 的内部设计的 ELISA，即 VM-IgG-RBD 和 VM-IgM-RBD，是一种利用病毒 Spike 糖蛋白 (S - 蛋白) 受体结合位点开发的专有检测方法。S 蛋白的受体结合位点 RBD 与人血管紧张素转换酶 2(ACE2) 受体之间相互作用，介导病毒与靶细胞的结合。S 蛋白具有高度的免疫原性，S1 亚基介导黏附结合，S2 亚基介导膜融合。RBD 被认为是能诱导产生中和抗体的主要的 SARS-CoV2 特异性靶点。

在该实验室早前发表的文章中，自研 ELISA 试剂盒设计是这样的：分别用多种不同浓度的重组 S 蛋白（包括 S1，RBD）包被平板，来自不同品牌、不同稀释度的多种 S1-SARS-CoV-2 抗体孵育并清洗后，用 HRP 标记的抗 IgG，IgM, IgA 二抗检测，用 3 份 NIBSC 提供的康复患者血清和混合 MNT 和 ELISA（商业化试剂盒）中的负对照人血清样本分别作为正负参照，用人 IgG1 抗 SARS CoV-2 S1 单抗、IgM 抗 SARS CoV-2 S1 单抗，和人 IgG1 抗 SARS CoV-2 RBD 单抗作为质量参照，以及用对流感、白喉。百日咳病毒的超敏人血清来验证对 SARS CoV-2 专一性，最后选出效果最好的一种 S1 蛋白和一种 RBD 蛋白（来自义翘神州）开发自研的 ELISA 检测。

用自研的 ELISA 方法和德国产市售的 Euroimmun S1 ELISA 试剂盒平行分析，并加上功能性 MN 分析验证。最后结果表明实验室自研的 VM-IgG-RBD,  VM-IgM-RBD 和 VM-IgA-RBD ELISA 检测与功能性 MNA 分析验证一致性最高。S1 ELISA 一致性不高。

基于 CPE 的活病毒微中和分析（CPE-based colorimetric live virus micro-neutralization assay，简称 MNA）评估病人血清样本中的 SARS‐CoV‐2 中和抗体

血清样品在 56 度热失活 30 分钟，按不同稀释度与等体积包含 100 TCID50 的 2019‐nCov/Italy‐INMI1 野生型病毒溶液 37 度共同孵育 1 小时，各取 100ul 加入 50% 汇合度的 VERO E6 单层细胞，37 度 5%CO2 培养 4 天，1. CPE 读数：用倒置显微镜观察细胞形态，能保护超过 50% 细胞不出现 CPE（cytopathic effect ）的最高血清稀释度作为中和效价。2. 显色法读数：培养 3 天后细胞用 0.02% 中性红孵育 1 小时并清洗，加入裂解液孵育后再 540nm 读数。

其中，用与 SARS‐CoV‐2 高度相似，同样结合 ACE2 受体的 SARS‐CoV 的 IgG1 单抗 CR3022（据报道能高效中和 SARS 病毒，靶向 SARS‐CoV 的 RBD 高度保守区域）作为对照，在 MN 中与含 100 TCID50 的病毒溶液共同孵育 1 小时后加入到 VERO E6 单层细胞中，72 小时培养未见任一浓度有中和活性，显示无交叉反应，即能高效中和 SARS 病毒的单抗在 MN 实验中不能中和 SARS‐CoV‐2 野生型毒株。用其他病毒超敏抗血清如针对腺病毒 4 型，流感病毒 AA/H1N1/California/7/2009 (10/218), 流感 B/Brisbane/60/2008 (13/312), 和流感 A/Anhui/1/2013 (15/248) 抗血清分别验证均无交叉反应。用 Sigma -IgA/IgM/IgG 人血清 (S5393‐1VL) 作为负对照。