哺乳动物生长激素(GH)是一种由脊椎动物脑垂体分泌的多肽激素，具有调节身体生长、促进新陈代谢的作用。20世纪50年代中后期，国外学者先后报道了注射外源猪垂体生长激素取得了显著效果。但用脑垂体提取pGH成本太高，长期难以产业化。Evock首次用DNA重组技术在大肠杆菌(E.coli)中表达了重组猪生长激素，其生物活性与由脑垂体提取的生长激素相同(Evock等，1991)。90年代国内学者也用E.coli系统成功地表达了重组猪生长激素(苏悌之等，1990；余旭平等，1991)。由于pGH在养猪业上明显的经济效益，克隆及表达猪生长激素基因在生产实践上有着重要意义。

GH在组织和细胞水平发挥作用的第一步是和靶细胞膜表面GHR结合，由GHR介导将信号传入细胞内从而产生一系列的生理效应。GHR存在于细胞质膜，广泛分布于各种组织细胞内。目前在肝、心、肾、肺、脑、肠、软骨、骨骼肌、脂肪等组织及淋巴细胞、胸腺细胞中都证实有GHR的存在，其中以肝脏的含量最高(Kelly等，1991；Hocquette等，1989)。猪的GHR基因cDNA最早是由Goffi于1990年克隆得到的(Cioffi等，1990)，并且猪与人的GHR cDNA有89％的同源性。Chowdhary将猪的GHR基因定位于16号染色体，并得到了一个线性连锁图谱：C9-FS-GHR-S0105(Chowdhary等，1994)。关于其他物种 GHR基因的表达研究较多(Leung等，1987)，猪的GHR基因的表达研究相对较少。

本研究构建了WZSP近交系GH和GHR基因的原核表达载体，并进行诱导表达，探讨猪GH和 GHR融合基因在E.coli中的最佳表达条件，为进一步研究GH和GHR的功能奠定基础。

(一)实验材料

实验材料与主要仪器类同研究三(从略)。

表达菌BL21(DE3)由本实验室保存备用。原核表达质粒pET-28a(+)为MERCK公司旗下的Novagen公司产品，见图1-59。

主要试剂如下：

(1)30％聚丙烯酰胺母液：将29g丙烯酰胺和1g N，N'-亚甲双丙烯酰胺溶于60mL ddH2O中，加热至37℃溶解，定容至100mL，4℃避光保存备用。

(2)12％SDS聚丙烯酰胺(分离胶，10mL)：3.3mL ddH2O，4mL 30％丙烯酰胺溶液，2.5mL浓

度为1.5mol/L的Tris(pH8.8)，0.1mL 10％SDS，0.1mL 10％过硫酸铵，0.004mL TEMED。

(3)5％SDS聚丙烯酰胺(积层胶，3mL)：2.1mL ddH2O，0.5mL 30％丙烯酰胺溶液，0.38mL浓度为1.0mol/L的Tris(pH6.8)，0.03ml。10％SDS，0.03ml。10％过硫酸铵，0.003mL TEMED。

(4)二硫苏糖醇(DTT，1mol/L)：转移100mg的DTT至微量离心管，加0.65mL的ddH2O配制成1mol/L的DTT贮存液。或在5g的原装瓶中加32.4mLddH2O，溶解后使用0.22μm滤器过滤除菌，分成小份贮存于-20℃。

(5)2×SDS凝胶加样缓冲液：100mmol/L Tris·HCl(pH6.8)，200mmol/L DTT，4％SDS(电泳级)，0.2％溴酚蓝，20％甘油。

(6)5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液(pH8.3)：7.55g Tris，47g甘氨酸，25mL 10％SDS，加ddH2O溶解定容至500mL。

(7)考马斯亮蓝染色液(100mL)：45mL甲醇，45mL ddH2O，10mL冰乙酸，0.25g考马斯亮

蓝R250。

(8)脱色液(1000mL)：450mL甲醇，450mL ddH2O，100mL冰乙酸。

(9)Kan：用灭菌去离子水溶解成储存浓度100mg/mL，-20℃保存备用。

(10)工具酶和T4连接酶均购自Takara公司。

(二)实验方法

1.原核表达载体的构建

(1)五指山猪近交系GH基因原核表达载体的构建  利用研究三获得的WZSP近交系GH基因的克隆连接载体-WZSPGH-pGEM质粒为模板，设计引物BPGH/EPGH(表1-47)，用ExTaq酶进行扩增，扩增出两端分别加有BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点的DNA片段，并再次利用pGEM-T-easy载体进行克隆，经测序验证无氨基酸改变后，利用BamHⅠ和EcoRⅠ分别双酶切该重缉质粒和原核表达载体 pET-28a(+)，并将外源片段及线性化的pET-28a(+)进行凝胶纯化回收、连接，并将连接产物转化表达型宿主菌BL-21，菌落PCR鉴定后提质粒进行双酶切验证，并将该重组质粒命名为 WZSPGH-pET-28a(+)。

(2)五指山猪近交系GHR基因原核表达栽体的构建

利用研究三获得的WZSP近交系GHR基因的克隆连接载体-WZSPGHR～pGEM质粒为模板，设计引物SPGHR/NPGHR(表1-47)，用LA Taq酶进行扩增，扩增出两端分别加有SalⅠ和NotⅠ酶切位点的DNA片段，并再次利用pGEM-T-easy载体进行克隆，经测序验证无氨基酸改变后，利用SalⅠ和NotⅠ分别双酶切该重组质粒和原核表达载体pET-28a(+)，并将外源片段及线性化的pET-28a(+)进行凝胶纯化回收、连接，并将连接产物转化表达型宿主菌BL-21，菌落PCR鉴定后提质粒进行双酶切验证，并将该重组质粒命名为WZSPGHR-pET-28a(+)。其技术路线如图1-60所示(以 WZSP GHR基因为例)。

PCR反应体系及扩增程序如下：

WZSP GH基因PCR反应体系：2.5μL 10×Buffer，1μL Former primer(10μmol/L)，1μL Reverse primer(10μmol/L)，2μL dNTPs(2.5mmol/L)，0.125μL Ex Taq，0.5μL质粒DNA模板， ddH2O补足至25μL。

WZSP GHR基因PCR反应体系：2.5μL 10×Buffer，1μL Former primer(10μmol/L)，1μL Reverse primer(10μmol/L)，4μL dNTPs(2.5mmol/L)，0.25μL LA Taq，0.5μL质粒DNA模板，ddH2O补足至25μL。

经过梯度PCR扩增仪对各个引物退火温度的摸索，确立了PCR反应程序：

PGH的反应程序为：94℃预变性5min→94℃变性30s→65℃退火30s→72℃延伸1min(30cycles)→72℃延伸10min→4℃保存。

PGHR的反应程序为：94℃预变性5min→94℃变性1min→66℃退火30s→72℃延伸2min(30cycles)→72℃延伸10min→4℃保存。

PCR反应程序结束后，1％琼脂糖凝胶检测PCR扩增产物。

2.原核诱导表达  进行原核诱导表达的操作步骤如下：

(1)挑取含重组质粒的菌斑至2mL LB(含Amp 50μg/mL)中37℃培养过夜。

(2)按1：50比例稀释过夜菌，一般将1mL菌加入到含50mL LB培养基的250mL锥形瓶中，37℃震荡培养至对数生长期，A550＝0.5～1.0(最好0.6，大约需2～3h)。

(3)取部分液体作为未诱导的对照组，余下的加入IPTG诱导剂至终浓度1mmol/L作为实验组(也可设IPTG浓度梯度)，两组37℃继续震荡培养。

(4)在诱导的不同时间(如：0.5、1、2、3、4、5h)分别取1mL放入EP管中。待全部收集完毕，室温高速离心1min收获沉淀，用100μL 1×SDS凝胶上样缓冲液重悬，混匀，100℃煮沸3min。

(5)然后室温12000g离心1min，冰上放置，取上清液作为样品进行点样。

(6)8～15V/cm电泳，至溴酚蓝迁移到分离胶底部。

(7)考马斯亮蓝染色，观察表达产物。

(三)结果与分析

1.原核表达载体的酶切鉴定  将WZSPGH-pET-28a(+)表达质粒用BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切，WZSPGHR-pET-28a(+)表达质粒用SalⅠ和NotⅠ双酶切，然后经1％琼脂糖凝胶电泳后，可以观察到目的分子量标准附近均切出条带如图1-61和图1-62。

2.表达质粒在大肠杆菌中的表达结果  以BL21(DE3)为表达菌在LB培养基中进行诱导表达，并以空载体(Null)作为阴性对照，分别在诱导后0、1、2、3、4和5h提取包涵体，并进行SDS-PAGE电泳检测。由图1-63可以看出，经IPTG诱导1、2、3和4h后，重组质粒在大肠埃希氏菌中均有表达，在预期分子量24800前后各时间段有蛋白带的特异性增加，以诱导3h的表达量最高，经Bandscan4.30软件扫描发现特异蛋白带约占菌液总蛋白的20％。在预期分子量70800前后各时间段并无蛋白带的特异性增加(图1-64)。究其原因可能有二：其一真核生物蛋白在原核中表达时，会存在密码子偏爱；其二，该蛋白在原核生物中不表达。

(四)讨论

1.五指山猪近交系GH基因的原核表达  改建和去除信号肽序列后的WZSP近交系GH基因克隆入原核表达载体pET-28a(+)的BamHⅠ和EcoRⅠ位点，由于克隆位点上游存在His·Tag/thrombin融合肽基因，所以WZSPGH-pET-28a(+)表达的是融合蛋白，分子量在25000左右，说明表达产物的分子量与上述理论数据相符。

众多学者对猪GH的原核表达进行了研究，其中因为选择的原核表达载体的不同，其表达量也有所不同。白俊杰等(2001)采用原核表达载体pBV220构建猪GH基因表达载体，融合蛋白表达量约占细胞总蛋白的20.5％。李凤等(2005)构建pGEX1-λT-pGH原核表达载体，经LPTG诱导4h后表达量最高达18.6％。朱江等(2005)采用与本实验相同的pET-28a(+)原核表达载体对猪GH基因进行原核表达，其表达量约占大肠杆菌胞浆蛋白的17％左右，而本研究中融合蛋白的表达量约占菌液总蛋白的20％。这表明外源基因的表达水平除了与表达载体的选择有关外，还与不同中外源基因的密码子偏爱性也关系密切(白俊杰等，2000)。

另外，外源基因在大肠杆菌内表达的研究中，诱导剂浓度和诱导时间的影响是十分重要的。只有诱导时间和IPTG的诱导条件最佳时，才能获得较高的表达量。IPTG是一种表达调控物质，对于不同的基因，它诱导表达的条件不一样。即使是同一种基因，在不同的表达体系中，它的诱导表达条件也不一样。本实验在优化了IPTG浓度和诱导时间对产物的影响后，筛选出了WZSP近交系GH基因在大肠杆菌中最佳诱导条件为：诱导时间3h，IPTG浓度为1.0mmol/L。经Bandscan(4.30)软件扫描发现， WZSP近交系GH基因特异表达产物相对含量较高，约占菌液总蛋白的20％，证明本试验构建的GH基因原核表达载体能高效表达融合蛋白，不仅使今后大量获取重组WZSP GH成为可能，也有利于对其生物学作用进行更深入的研究。

2.五指山猪近交系GHR基因的原核表达  经酶切、测序验证，通过研究成功构建了WZSP近交系 GHR基因的原核表达载体，并在E.coli.表达菌BL21(DE3)中进行诱导表达，然而SDS-PAGE电泳检测，并无特异性条带出现，经分析可能存在以下几个方面的原因：

(1)在原核细茵中具有密码子偏爱性  蛋白质翻译过程中，tRNA携带相应的氨基酸到核糖体上的 A位，如果结合到A位的tRNA与该密码子相对应，就可进行肽链的合成与延伸，如果不合适，则将使蛋白翻译停顿，更换并直接找到正确的tRNA。原核生物中，由于不同tRNA含量的差异导致了对不同密码子的偏爱性。对于相应tRNA丰富的密码子，正确的氨基酸会很快连接上，而相应tRNA稀少的密码子，要经过多次相互辨认才能找到正确的tRNA。如果相同的稀有密码子连续出现，就会抑制蛋白质合成，甚至发生密码子错配。统计后发现，AGA、AGC、AUA、CCG、CCT、CTC、CGA和 GTC等8种密码子是大肠杆菌的稀有密码子(Grosjean等，1982)。如果外源基因含有较高比例的稀有密码子，其表达效率往往不高。而在WZSP近交系GHR的编码区共有69个稀有密码子，其中CCT(14)、AGC(11)和CTC(11)最多。在此情况下，按照常规的实验方法，想得到原核表达产物就显得比较困难了，因此才出现了原核表达无结果的现象。

(2)生长因子不能在单细胞生物中表达  由于GHR是一个细胞生长因子，它存在于多细胞生物中。然而在大肠杆菌这些单细胞生物中，若只考虑自身而不考虑对其周围生物的影响来说，是没有必要存在这些细胞因子的。因为它们是通过彼此之间的竞争而得以生存的，如果存在，势必造成自身的完全灭亡，这对于单细胞生物来说是不现实的(Curtin等，2003)。而FN3只存在于真核生物中，在一定程度上也证实了这一结论。

当然，没有表达产物，其原因也是多方面的，可能还与载体的选择、培养的条件等有关，这里就不再一一分析。