斑马鱼胚胎毒性试验：评估己烯雌酚和雌二醇的体外发育毒性

摘要：在斑马鱼胚胎毒性试验（ZET）中研究了己烯雌酚（DES）的发育毒性。这是为了研究ZET是否能比胚胎干细胞试验（EST）更好地捕捉DES的发育毒性，与体内数据相比，胚胎干细胞试验（EST）先前显示对DES诱导的发育毒性预测不足，可能是因为EST没有捕捉到发育过程中的后期事件。ZET结果显示DES诱导斑马鱼胚胎生长迟缓、累积死亡率和畸形（即诱导心包水肿），而内源性ERα激动剂17β-雌二醇（E2）仅表现出生长发育迟缓和累积死亡率，且效力比DES低。此外，与ERα拮抗剂氟维司群共暴露可抵消DES诱导的斑马鱼胚胎心包水肿的形成，表明ZET捕获了ERα在DES发育毒性潜在作用模式中的作用。ZET区分了DES和E2的发育毒性效应，同时证实了ERα在介导DES发育毒性中的作用。此外，与体内数据的比较显示，在定量方面，ZET也没有捕捉到DES作为发育毒物的相对高的体内效力。

关键词：发育毒性  己烯雌酚  17β-雌二醇  雌激素受体α（ERα，ESR1）

简介：己烯雌酚（DES）是一种合成激素，1938年至1971年间首次被用于孕妇预防流产和早产，治疗月经问题和癌症。然而，尽管未观察到这些声称的有益作用，但据报道有不良反应，包括自然流产，中期妊娠流产，早产，新生儿死亡，亚/不育和新生儿生殖组织癌，均指向发育毒性。随后的体内动物研究证实了DES的发育毒性，包括诱导小鼠和大鼠胚胎死亡，吸收和形态变化。雌激素受体α（ERα；ESR1）参与了DES诱导的雄性和雌性新生小鼠生殖道畸形和表型改变的作用方式，而ERα基因敲除小鼠未观察到这种作用。在我们最近的体外发育毒性研究中，也证实了ERα（ESR1）在DES介导的发育毒性中的作用，在该研究中，DES在胚胎干细胞试验（EST）的ES-D3细胞分化测定中测试为阳性，而该DES- ERα拮抗剂氟维司群可以抵消DES诱导的ES-D3细胞向搏动心肌细胞分化的抑制。然而，当将EST数据与DES和其他发育毒物的体内发育毒性数据相关联时，EST似乎在很大程度上低估了DES的发育毒性。

斑马鱼胚胎毒性试验（ZET）理论上可以更好地反映这种后期发育效应。ZET是最新的体外替代性发育毒性试验方法之一，通常与经验证的胚胎干细胞试验（EST）和大鼠植入后全胚胎培养（WEC）一起使用。整个胚胎发育过程中生物体的透明性和快速的胚胎生长促进了斑马鱼胚胎作为体外发育毒性模型的应用。此外，斑马鱼胚胎的发育被认为与包括人类在内的脊椎动物的胚胎发生非常相似。本研究的目的是评估DES在ZET中的发育毒性，并将这种合成的ERα激动剂与内源性ERα激动剂17β-雌二醇（E2）的效果进行比较。此外，研究了体内和在EST中观察到的ERα的作用是否也可以证明DES在ZET中的体外发育毒性。为此，在不存在和存在ERα拮抗剂氟维司群的情况下，在ZET中对DES的体外胚胎毒性进行了定量。

斑马鱼胚胎毒性试验（ZET）：在受精（hpf）后4-5小时开始ZET，并在96 hpf结束，因为这涵盖了斑马鱼胚胎的整个器官发生。在4-5 hpf暴露时斑马鱼胚胎的绒毛膜仍保持完整。 斑马鱼胚胎暴露在24孔板中进行，并用封口膜盖密封。24孔板的20个孔用于暴露于一种浓度的测试化合物，而其他四个孔用于板内对照。通过将400倍浓度的试验化合物储备溶液（溶解于二甲基亚砜）与胚胎水混合制备暴露介质。然后将暴露介质转移到24孔板的20个孔中，每孔2 ml暴露介质，对于板内对照，每个孔添加2 ml胚胎液。每孔加入相应的溶液后，每孔添加1个斑马鱼胚胎。然后用封口膜将板密封，以防止测试化合物在整个曝光期间（最高96 hpf）蒸发。E2在胚胎液中的浓度范围为30μM，而DES在胚胎水中的浓度范围为10μM。每个独立实验包括溶剂对照（0.25%v/v DMSO）、阳性对照（4μg/ml 3,4-二氯苯胺）和阴性对照（仅胚胎液）。平板在26℃孵育，光照时间为14小时光照：10小时黑暗。根据广义形态学评分（GMS）系统，每24小时用倒置显微镜对胚胎发育异常和累积死亡率进行一次评分（t=0为0 hpf），直至96 hpf。偏离正常发育阶段，如尾巴不完全脱落、眼、鳍、口发育不完全、胚胎发育不全等，会导致较低的总GMS值，相当于一定程度的发育迟缓。96hpf时终止试验。如果观察到以下情况，则认为ZET有效：每个暴露板的内板对照中≤1个死胚（4个），阴性对照板中≤3个死胚（24个）（至少87.5%存活率），溶剂对照板（0.25%v/v DMSO）中≤2个死胚（20个）；阳性对照板中≤14个活胚胎（20个中的）（4μg/ ml 3,4-二氯苯胺；暴露于阳性对照应至少导致96 hpf的30％死亡率）。24小时后凝结的胚胎被认为是死亡的（死的乳白色胚胎在显微镜下呈黑色）。如果在48小时后没有形成体节，胚胎也被认为是死的，当心跳在48、72和96小时后消失时，胚胎也被认为是死的。除GMS外，还评估了胚胎的6个畸形终点，包括卵黄囊水肿、心包水肿（心脏畸形）、畸形体型、畸形尾巴（即尾巴扭结或尾鳍畸形）、颌骨和头部畸形以及耳囊畸形。

先前发表的研究使用所谓的致畸指数（TI）对使用ZET的致畸化合物进行分类。 为此，在本研究中还定义了DES或E2的TI。为了评估ZET中观察到的发育毒性是否通过ERα介导，在没有或存在ERα拮抗剂氟维司群的情况下进行了DES对斑马鱼胚胎发育影响的研究。为此，首先确定了不影响斑马鱼胚胎发育的氟维司群浓度，然后将其应用于共同暴露研究。这些研究中的最终溶剂浓度也是0.25%v/v二甲基亚砜。

ZET中E2和DES的体外发育毒性：暴露于E2或DES均可引起ZET中GMS评分和胚胎存活的浓度依赖性作用。GMS的BMD分析表明DES的效价比E2高2.8倍，BMC05值分别为0.63和1.77μM。图1还显示了对96 hpf存活率的浓度依赖性影响，BMD分析的相关结果提供了DES和E2的BMC05值分别为1.5和4.7μM，表明基于该终点，在ZET中DES的效力是E2的3.1倍。

图1、ZET中E2和DES对GMS评分和生存率的浓度依赖性影响

斑马鱼胚胎和幼鱼的畸形：除了GMS之外，还针对某些特定的畸形发生终点对E2和DES的畸形发生能力进行了评估，重点是那些暴露于已知发育毒物后被证明受到特定影响的终点。终点包括卵黄囊水肿，心包水肿（心脏畸形），体形畸形、尾部畸形（即尾巴扭结或尾鳍畸形），头颌畸形，以及耳囊畸形。试验终点为96hpf。图2在暴露于E2的胚胎中未观察到明显的心包水肿。有趣的是，与E2相反，DES以浓度依赖性方式诱导心包水肿（图3），与3μM和5μM的溶剂对照组相比有显著差异。此外，DES还诱导了其他一些E2未观察到的形态学效应，包括短尾、弯尾和卵黄囊水肿。

图2、斑马鱼胚胎暴露于不同浓度的E2和DES的形态分析的代表性图像显示了DES引起的心包水肿（红色圆圈），暴露于浓度小于10μM的E2时未观察到。

图3、DES在ZET中的浓度依赖性发育效应。

图4、DES和E2对斑马鱼胚胎水肿（心包和卵黄囊）形成的浓度依赖性影响。

图5、表现为（A）96 hpf时的正常胚胎（无表型变化）和在ZET中观察到的主要是暴露于DES-而非暴露于E2的斑马鱼胚胎不良发育影响，包括（B）心包水肿形成，（C）小眼畸形头部和卵黄囊水肿畸形，（D）“短尾”表型表现短于正常的尾巴，尾巴有淤血和卵黄囊水肿；（E）未孵化的表型，表现仍位于绒毛膜上的胚胎，有卵黄囊水肿和淤血；（F）向下弯曲的尾巴，与水平方向/变形体形相比，尾巴向下。关于致畸性或畸形分类（即TI），主要在暴露于DES的斑马鱼胚胎中观察到3个畸形终点，包括心脏畸形（心包水肿）、尾部畸形（短而弯曲的尾部）和卵黄变形（卵黄囊水肿）。暴露于E2时未在很大程度上观察到这些终点，未观察到浓度依赖性的不良反应，也未观察到与溶剂对照有统计学意义的显著影响。此外，值得一提的是，BMC50只能用于DES诱导的心包水肿评分，而不能用于上述其他两个终点，因为在96 hpf时存在未孵化的胚胎。换言之，对于未孵化的斑马鱼胚胎来说，很难评估其尾部和身体的畸形。因此，基于心包水肿作为唯一的畸形终点，通过将存活率（累积死亡率）（8.8μM）的LC50（BMC50）除以心包水肿形成BMC50（2.5μM），DES的TI为3.5。鉴于E2没有引起这种不良反应，因此无法确定E2的TI。

ERα拮抗剂氟维司群对DES诱导斑马鱼胚胎发育毒性的影响：评估了氟维司群在ZET中的发育效果和体外胚胎毒性潜力。结果表明，在3μM以下的氟维司群对GMS评分无影响，无畸形或变形。在10μM时，GMS评分下降而未观察到死亡率，30μM的最高浓度导致所有暴露斑马鱼胚胎的累积死亡率（96 hpf）。基于这些结果，选择了浓度为3μM的氟维司群来研究ERα拮抗剂对DES诱导的ZET发育毒性的影响，因为在此浓度下氟维司群不干扰斑马鱼的发育。这些结果表明，在3μM浓度下，ERα拮抗剂氟维司群显著减少了DES诱导的斑马鱼胚胎心包和卵黄囊水肿的形成，但在较高浓度的DES（3和5μM）下，抑制作用并不完全。

结论：ZET可以检测DES的体外发育毒性，揭示DES与E2的差异。此外，本研究还证实了ERα在ZET中介导DES发育毒性的作用，而ZET在检测灵敏度方面并不优于EST。

原文出自：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0887233321000138