糖尿病小鼠模型：雷米普利对肾脏，肺和心脏ACE2的影响

摘要：严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2（SARS-CoV-2）导致COVID-19。感染的主要器官是肺，病毒利用血管紧张素转换酶2（ACE2）作为受体进入靶细胞。在这种情况下，关于肾素-血管紧张素系统（RAAS）阻滞剂的使用引起争议，因为这些药物可能会增加某些组织中ACE2的表达并可能增加SARS-CoV-2感染的风险。这在糖尿病患者中尤其值得关注，因为糖尿病是COVID-19的危险因素。给予12周龄糖尿病小鼠（db/db）雷米普利或溶媒对照8周。非糖尿病db/m小鼠作为对照。在这些动物的肺，肾和心脏中研究了ACE2的表达和活性。与db/m组相比，db/db组小鼠肾脏ACE2活性增加，而雷米普利组无明显影响。db/db小鼠与db/m小鼠肺组织相比，ACE2无明显差异，雷米普利也无明显作用。糖尿病降低心脏ACE2活性，雷米普利显著增加心脏ACE2活性。在2型糖尿病小鼠模型中，雷米普利对肾脏或肺部的ACE2活性没有显著影响。因此，RAAS阻滞剂或至少是血管紧张素转换酶抑制剂不太可能通过增加ACE2而增加SARS-CoV-2感染的风险。

关键词：ACE2  COVID-19  糖尿病  RAAS阻滞剂  肺脏

简介： 肺是COVID-19的主要受累器官。SARS-CoV-2使用跨膜蛋白血管紧张素转换酶2（ACE2）作为受体之一进入靶细胞，这一特征与SARS-CoV（引起SARS流行的病毒）相同。ACE2是一种羧肽酶，分别将血管紧张素-I（Ang-I）和血管紧张素II（Ang-II）转化为血管紧张素-1-9（Ang-1-9）和血管紧张素-1-7（Ang-1-7）。这种酶是肾素-血管紧张素-醛固酮系统（RAAS）替代途径的一部分。它的激活本身具有血管舒张作用。ACE2在肾脏近端肾小管细胞中广泛表达。在较小程度上，它也在肺（2型肺泡细胞）和心脏中表达。SARS-CoV感染导致肺组织ACE2表达下降。在急性肺损伤中，ACE2缺乏与增强的组织损伤有关。因此，RAAS在SARS-CoV-2感染所致肺损伤的严重程度中起着重要作用。此外，RAAS的失调通常在糖尿病中可见，并且已经在糖尿病患者的肾脏和心脏中发现了ACE2表达的变化。分析数据显示，SARS-CoV-2感染者的糖尿病患病率并不高，尽管糖尿病患者显示患严重SARS-CoV-2感染的风险增加，结果更差。大约40％的2型糖尿病患者患有高血压，因此接受RAAS阻滞剂治疗：血管紧张素转换酶抑制剂（ACEis）或血管紧张素II 1型受体阻滞剂（ARB）。此外，这些药物还广泛用于治疗几种肾脏疾病中的非糖尿病性高血压和蛋白尿。在COVID-19大流行期间，关于RAAS阻滞剂的使用引起了争议，因为在实验模型中的一些研究表明，用这种药物治疗增加了心脏组织和肾血管中ACE2的表达。由于这一临床前证据，有人认为RAAS阻断剂治疗可增加对SARS-CoV-2感染的易感性，从而产生一个悖论，因为通常认为ACE2水平升高对组织具有保护作用。尽管有上述研究的结果，但没有足够的证据证实这些药物能促进ACE2表达，因为使用类似实验模型的其他作者尚未观察到RAAS阻滞剂诱导的ACE2调节。此外，RAAS阻滞剂对肺ACE2调节的影响也很少被评价。在最近的一份研究报告中，Wysocki及其合作者描述了RAAS阻断剂对C57BLKS/J小鼠肾、肺ACE2的调节作用。在2型糖尿病小鼠模型中，我们研究了ACEi（雷米普利）对肾脏、肺和心脏ACE2的影响。

8周龄雄性瘦素受体缺陷型糖尿病小鼠（db/db）和非糖尿病杂合子同窝仔鼠（db/+）购自Charles River。小鼠被分为4组，每笼最多4只，随意饮食饮水。适应4周（12周龄的小鼠）后，db / db组小鼠（n = 7）连续8周给予溶于水中的雷米普利（20 mg / L）（8 mg / kg /天）。给予溶媒的db / db组（n = 7）和db / m组（n = 7）小鼠被用作对照。给药前及给药后每两周监测一次体重、血糖和血压。给药结束后，在戊巴比妥钠麻醉下处死动物。并通过心脏穿刺获得全血以获取血清，然后用冷的1x PBS灌注小鼠。然后取出肾脏，心脏和肺，在液氮中速冻并保持在-80°C直至使用。 此外，将肾脏和心脏的一部分固定在10％福尔马林中，并用石蜡包埋以进行组织学分析。

ACE2分析：分析肾脏、肺和心脏提取物中ACE2基因和蛋白表达以及ACE2活性。血清仅评估ACE2活性。ACE2基因表达通过RT-qPCR进行测量，并使用次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶1（HPRT）作为管家基因，采用ΔΔCT方法进行相对定量。通过蛋白质印迹评估ACE2蛋白水平，并通过荧光酶法测定ACE2活性。另外，用免疫组化方法在肾脏和心脏中检测了ACE2。

雷米普利降低db / db组小鼠的血压：本研究的最终目的是评估（1）糖尿病背景如何调节肾，肺和心脏ACE2，以及ACEi治疗是否可以改变糖尿病中ACE2。为此，给予12周龄的糖尿病小鼠（db / db）雷米普利（8mg / kg /天）连续8周。以溶媒db/db和非糖尿病小鼠（db/m）为对照。如预期的那样，与db / m小鼠相比，所有接受雷米普利和溶媒的糖尿病小鼠在实验结束时均表现出高血糖和体重增加。在我们的实验环境中，与对照db/m小鼠相比，db/db小鼠的收缩压和舒张压降低。如所预期的，与db / db溶媒和/或db / m组相比，雷米普利给药8周显著降低了收缩压，表明雷米普利治疗有效。

未给予雷米普利的db/db组小鼠肾脏ACE2增加：使用两种方法研究了用雷米普利治疗的db / m，溶媒db / db和db / db组小鼠中肾脏中ACE2的调节：（1）通过qPCR表达ACE2基因和（2））荧光底物法测定ACE2活性。与db/m组小鼠相比，溶媒db/db组小鼠肾脏ACE2基因表达增加，雷米普利可逆转这种效应。肾脏ACE2活性也有增加的趋势，但雷米普利没有改变其活性。在膜浓缩蛋白提取物中，db/db动物的ACE2活性明显高于db/m，雷米普利对肾膜浓缩提取物中ACE2活性没有明显的影响。在肾组织切片中，ACE2表达位于肾小管细胞的刷状缘，与db / m相比，染色在db / db中更为突出。与未给药的db/db相比，雷米普利给药动物肾脏中的ACE2分布没有明显变化。

图1、雷米普利对db/m、db/db和db/db小鼠肾脏（A和D）、肺（B和E）和心脏（C和F）ACE2基因表达和活性的影响。

图2.雷米普利对db / m，db / db和db / db小鼠的肾脏（A），肺（B）和心脏（C）的膜富集提取物中的ACE2活性。

图3. ACE2在雷米普利给药的db / m，db / db和db / db小鼠的肾脏和心脏组织中的定位。

雷米普利对db/db组小鼠肺组织ACE2无影响：在肺部，采用与肾脏相同的方法研究ACE2。我们发现db/m和溶媒db/db组之间在ACE2基因表达方面没有差异，主要与ACE2 mRNA表达的高度可变性有关。未能发现肺和ACE2活性之间的差异。此外，在db / db小鼠的肺部，雷米普利未引起ACE2基因表达和活性的改变。

db / db组小鼠心脏中的ACE2降低，雷米普利使ACE2水平正常化：我们还分析了心脏中的ACE2。在心脏组织中，ACE2在db/db和db/m组显著降低，这两种情况都与mRNA水平和ACE2活性有关。与db/m组小鼠相比，db/db组小鼠膜富集提取物中ACE2的活性也显著降低。雷米普利治疗可将ACE2活性显著恢复至对照组db / m小鼠中观察到的水平。然而，雷米普利不能改变心脏ACE2基因的表达。此外，我们评估了ACE2在心脏组织中的分布，其中ACE2染色显示弥散性分布，某些区域ACE2染色增加。我们注意到，与db / m组小鼠相比，在db / db组小鼠中的染色强度更温和。 雷米普利似乎恢复了染色强度。

db/db组小鼠血清ACE2活性升高，雷米普利对其无影响：最后，我们测定了雷米普利治疗的db/m、db/db和db/db组小鼠血清中ACE2的活性。与db/m组小鼠相比，db/db组小鼠血清ACE2活性显著升高，雷米普利不能减轻这种影响

图4、db/db组小鼠血清ACE2活性升高，雷米普利对其无影响

总之，这里我们在糖尿病小鼠模型中证明ACE抑制仅在糖尿病心脏中产生ACE2上调。在肾脏或肺部不会发生这种情况，这强化了以下观点：在大多数组织中，RAAS阻滞剂不会增加ACE2的表达水平。

原文出自：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0303720721001076