斑马鱼仔鱼巨噬细胞迁移的抑制作用证明了人CCR2抑制剂的体内功效

摘要：CCR2-CCL2和CXCR3-CXCL11趋化因子信号轴通过招募白细胞到受损组织或感染部位参与炎症反应，因此是治疗炎症性疾病的潜在药理靶点。尽管已开发出多种CCR2正构和变构抑制剂，但这些化合物均未获准用于临床，这凸显了需要一种快速，简单且可靠的临床前测试系统来确定CCR2抑制剂的体内功效。本文中，我们显示了人类CCL2和CXCL11驱动斑马鱼幼虫中的巨噬细胞募集，并且由于趋化因子系统的高度保守性，为人类设计的CCR2抑制剂也限制了该模型生物体中的巨噬细胞募集。我们证明了三种顺位和两种变构CCR2抑制剂的抗炎活性，它们利用损伤对巨噬细胞的募集作为其功效读数，同时评估毒性。这些结果为在斑马鱼模型中筛选CCR2抑制剂提供了理论依据。

关键词：趋化因子受体  抗炎  抑制剂  巨噬细胞  体内  筛选

简介：趋化因子及其受体通过介导白细胞募集到炎症部位而在几个病理过程中发挥核心作用。CCR2（CC趋化因子受体2）在单核细胞和巨噬细胞上组成性表达，而少数自然杀伤细胞，T细胞，内皮细胞和嗜碱性粒细胞在炎性条件下表达该受体。CCR2主要与CCL2（MCP-1）结合，但也与CCL8（MCP-2），CCL7（MCP-3），CCL13（MCP-4）和CCL16结合，从而协调细胞的募集和协调炎症过程的 免疫反应。在以慢性炎症和单核细胞向特定组织浸润为特征的疾病中，CCL2表达升高，例如动脉粥样硬化，多发性硬化，阿尔茨海默氏病和缺血性中风。最近的研究表明，该受体还与包括糖尿病在内的代谢疾病有关。除CCR2外，其他几种趋化因子受体在促使白细胞向炎症部位募集方面也很重要。CXCR3是其中的一个关键角色，它在多种免疫和非免疫细胞类型上表达，已被广泛研究与癌症炎症、慢性炎症疾病和自身免疫疾病的关系，CXCR3在适应性免疫，特别是T细胞应答中的作用最为人所知，但它也参与了多种天然免疫细胞的功能，如肥大细胞、嗜碱性粒细胞和巨噬细胞。与CCR2一样，CXCR3，CXCL9 / MIG，CXCL10 / IP10和CXCL11 / I-TAC的配体在多种病理条件和组织损伤下被诱导。因此，CCR2和CXCR3抑制剂是一种很有吸引力的抗炎药，可减少白细胞向炎症灶的募集，并用于治疗多种病理状况。在本研究中，我们重点研究了CCR2及其与CXCR3的相互作用在单核细胞/巨噬细胞募集中的作用。小鼠CCR2的缺失导致单核细胞向炎症部位募集的显著减少。尽管人类和斑马鱼之间存在进化距离，，但已证明，人类配体CCL2可以通过斑马鱼胚胎中的CCR2受体同源物募集原始单核细胞/巨噬细胞（以下称为巨噬细胞）。此外，在斑马鱼胚胎和仔鱼发育过程中，该受体的敲除可减少感染和损伤时原始巨噬细胞的招募，表明从鱼类到哺乳动物，CRR2在炎症反应中的作用得以保留。

Cxcr3存在于斑马鱼的三种变体中，Cxcr3.2可被认为是人CXCR3在斑马鱼幼虫巨噬细胞和嗜中性粒细胞中的功能同源物，而Cxcr3.1在此发育阶段未检测到表达，Cxcr3.3是一种非典型受体，可拮抗Cxcr3.2的功能。与Ccr2相似，我们已经证明Cxcr3.2的缺失也减少了巨噬细胞向损伤组织和感染灶的募集。此外，我们使用了人类CXCR3抑制剂来有效阻断斑马鱼胚胎中Cxcr3.2介导的巨噬细胞募集。这些和其他研究已经证明了人类和斑马鱼之间的趋化因子信号轴在功能上的显著保守性，支持了斑马鱼幼虫作为人类日益增长的免疫相关疾病（如炎症疾病、传染病和癌症）模型的使用。此外，利用这种进化的功能保守性，我们建议斑马鱼仔鱼模型可以补充基于细胞的筛选，并作为一个强大的体内平台，以评估人类CCR2抑制剂在组织环境中的功效。

几项研究证明了斑马鱼仔鱼用于抗炎药物筛选的有用性。斑马鱼的胚胎/仔鱼模型由于具有光学透明性和多种可用的分子工具，因此可以在整个生物体水平上实时跟踪荧光标记的白细胞。斑马鱼体型小，繁殖力高，繁殖时间短，因此可以筛选较大且相对均匀的样本群。斑马鱼的幼虫原则上可以渗透大多数小分子，因此可以通过浸泡来施用化合物，并且可以通过生存曲线以及追踪发育和形态异常来轻松获得毒性。考虑到该模型的所有优点，我们认为，利用暴露于人CCR2抑制剂后的活斑马鱼幼虫的非侵入性成像技术，可提供一种手段来鉴定潜在的治疗化合物并评估其对白细胞特性的影响。

在目前的工作中，我们评估了斑马鱼幼虫模型的有用性，使用对人CCR2的已知正构和变构抑制剂来稳健地筛选Ccr2抑制剂。我们发现斑马鱼Ccr2和Cxcr3.2都通过巨噬细胞的募集参与炎症反应，与单个受体的消融相比，两种受体的同时消融导致巨噬细胞募集进一步减少。将人CCL2和CXCL11蛋白局部注射到斑马鱼幼虫的后脑室内可诱导巨噬细胞趋化，这表明人和斑马鱼体内的趋化因子信号轴具有足够的保守性，可以实现种间串扰。此外，我们还发现CCR2抑制剂能有效阻断巨噬细胞募集和表型CCR2敲除。因此，我们证明了在斑马鱼仔鱼中利用损伤募集巨噬细胞作为其功效判读，在斑马鱼仔鱼中筛选CCR2抑制剂的可行性。

Ccr2-Ccl2和Cxcr3.2-Cxcl11aa趋化因子信号轴参与了斑马鱼仔鱼的炎症反应：为了确定Ccr2-Ccl2和Cxcr3.2-Cxcl11aa趋化因子轴对不同炎症刺激的作用，我们分析了感染或创伤时Ccl2和Cxcl11aa的表达，并提出这些基因的诱导是否依赖于Myd88（髓系分化反应基因88），作为一种通用的TLR适配器分子，参与对病原体和损伤的炎症反应。我们的数据表明，ccl2和cxcl11aa在感染分枝杆菌病原体和断尾损伤的野生斑马鱼仔鱼中均被诱导。相反，在myd88突变仔鱼中取消了这些基因的诱导。这些数据表明myd88是ccl2和cxcl11aa诱导所必需的，并且提示Ccr2-ccl2和Cxcr3-Cxcl11信号轴都与创伤和Mm感染的反应有关。我们和其他人先前的研究表明，在cxcr3.2突变仔鱼和ccr2基因敲除条件下，巨噬细胞募集减少。我们给wt和cxcr3.2突变体注射ccr2吗啉，以检测两种趋化因子受体的缺失是否会比单一受体的缺失导致进一步的巨噬细胞募集减少。与注射PBS的对照组相比，注射吗啉的wt和cxcr3.2突变体在截尾后的巨噬细胞募集减少，证实两种受体的缺失对炎症反应的影响大于单一受体的缺失。

图1、Ccl2/Ccr2和Cxcl11aa/Cxcr3.2趋化因子信号轴参与了斑马鱼幼虫的炎症反应。

整个仔鱼的定量PCR数据显示，野生型斑马鱼仔鱼在受伤（切尾）和感染后均诱导了ccl2和cxcl11aa，而myd88突变仔鱼却没有。ccr2的敲除和cxcr3.2的突变导致损伤后巨噬细胞募集减少，并且两种受体的缺失进一步降低了募集（E），代表性图像显示了截尾试验中巨噬细胞（mpeg1：mCherry）募集的面积。

人CCL2和CXCL11趋化因子特异性地吸引斑马鱼仔鱼中的巨噬细胞：为了从功能上评估人类趋化因子是否在斑马鱼体内发挥其趋化活性，我们将巨噬细胞特异性引诱剂CCL2和CXCL11局部注射到斑马鱼胚胎的后脑中，并在3小时后对脑室内的巨噬细胞进行定量。如前所述，与PBS对照组相比，CCL2有效地募集巨噬细胞。CXCL11触发了类似水平的巨噬细胞募集。为了排除由于注射异种趋化因子蛋白引起的非特异性巨噬细胞募集，我们注射了人趋化因子CXCL8，它是一种中性粒细胞趋化剂，并观察到中性粒细胞而不是巨噬细胞被募集到后脑，证实人趋化因子诱导斑马鱼巨噬细胞或中性粒细胞的细胞特异性趋化。

图2、局部注射人CCL2和CXCL11蛋白可将巨噬细胞吸引到斑马鱼幼虫的后脑室内。

人CCR2抑制剂CCR2-RA-[R]抑制斑马鱼幼虫巨噬细胞的募集：CCR2-RA-[R]是一种CCR2拮抗剂，，与G蛋白结合的受体的变构细胞内位点结合。我们的目的是利用斑马鱼仔鱼后脑巨噬细胞募集实验来评价CCR2-RA-[R]在体内的疗效。为了预测这种抑制剂是否可以跨物种起作用，我们评估了人类和斑马鱼受体之间共享的CCR2-RA- [R]结合位点内的完整蛋白质同一性和相似性。Zv11斑马鱼基因组参考序列包含两个被标注为Ccr2的基因。被称为Ccr2的蛋白质与人CCR2具有44％的同一性，而由第二个基因编码的蛋白质具有43％的同一性。根据人类CCR2晶体结构中显示的CCR2-RA-[R]结合模式，评估了人类和斑马鱼CCR2和CXCR3受体中预测的CCR2-RA-[R]结合位点之间的相似性。发现人CCR2中CCR2-RA-[R]-结合的关键残基在斑马鱼CCR2中高度保守，在两个变体中显示70.5%的同源性，但在人CXCR3（65%的同源性）和斑马鱼CXCR3.2中也显示出同样的同源性。由于变构细胞内结合位点之间的高度相似性，我们使用CCR2-RA- [R]测试了Ccr2和Cxcr3.2对趋化因子诱导的巨噬细胞募集的抑制作用。观察到，当仔鱼与CCR2-RA-[R]孵育时，CCL2介导的巨噬细胞募集减少，而在CCR2-RA-[R]处理后，CXCL11介导的巨噬细胞募集未受影响。与单独注射CCL2相比，共注射CCL2和CXCL11不能明显增强巨噬细胞的募集，CCR2-RA-[R]孵育使巨噬细胞的募集降低到与CXCL11诱导的水平相似的水平，与抑制剂仅影响Ccr2介导的招募一致。CCR2-RA- [R]仅在wt仔鱼中减少了巨噬细胞募集，而在ccr2敲除仔鱼中却没有，支持抑制剂通过上述Ccr2变体发挥其作用。

图3、人CCR2抑制剂CCR2-RA-[R]抑制斑马鱼仔鱼巨噬细胞的募集。

斑马鱼仔鱼是人CCR2抑制剂的强大筛选平台：为了进一步评估斑马鱼幼虫模型用于筛选CCR2抑制剂的适用性，我们开发了一个工作流程，使用损伤来募集巨噬细胞筛选化合物，以此作为读取其功效的方法。将一批50只斑马鱼仔鱼与每种感兴趣的化合物预孵育2小时，然后进行截尾，并将截尾的仔鱼在化合物中再孵育4小时。使用DMSO（赋形剂）作为所有孵育的对照。此后固定仔鱼，并对聚集到受损区域的巨噬细胞进行成像和定量。为了确定试验浓度，我们进行了毒性评估。我们发现变构体化合物比正构体抑制剂毒性更大。变构抑制剂JNJ-27141491和SD-24在浓度高于10μΜ时具有毒性，在预孵育2小时后杀死大多数仔鱼。

图4、 斑马鱼仔鱼是CCR2抑制剂的强大筛选平台。

讨论：CCR2-CCL2趋化因子信号轴与多种炎症性疾病相关，因此被认为是抗炎药物开发的一个有吸引力的靶点。正构和变构CCR2抑制剂均已开发，但没有一种已显示出足以用于临床的功效。这说明需要有效的临床前试验系统来确定CCR2抑制剂的体内疗效。在这里，我们提出斑马鱼仔鱼模型作为CCR2抑制剂的体内筛选平台，它能够跟踪活生物体中白细胞的募集，同时评估毒性。根据我们的研究结果和先前的研究，两个主要的信号轴，Ccr2-Ccl2和Cxcr3-Cxcl11，通过介导巨噬细胞的募集而参与斑马鱼仔鱼的炎症反应。在遗传或化学上抑制这两个轴之一会导致巨噬细胞募集的大量减少，这表明在斑马鱼仔鱼的巨噬细胞募集中其他趋化因子受体的作用是有限的。与哺乳动物相似，成年斑马鱼的趋化因子网络可能具有更大的复杂性。 较简单的斑马鱼仔鱼趋化因子系统在本研究中对于药物筛选方法具有实际优势。考虑到通常认为CCR2和CXCR3共同导致炎症性疾病，并且两种受体的斑马鱼同源物都驱动伤口诱导的巨噬细胞募集，因此斑马鱼幼虫还可以作为筛选平台来测试这些受体的特异抑制剂。

原文出自：Inhibition of macrophage migration in zebrafish larvae demonstrates in vivo efficacy of human CCR2 inhibitors - ScienceDirect