细胞传代的N个疑惑如何解?看完这份干货就够了

来源:瑞沃德 发布时间:2021年05月08日 浏览次数: 【字体: 收藏 打印文章

为什么传代后细胞存活率不佳?

为什么细胞生长不均匀?

为什么细胞生长越来越慢?

……

细胞传代作为细胞培养中的重要步骤

经常有朋友在后台追问十万个为什么

今天咱们聊聊细胞传代教你掌握传代的技巧

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1.什么是细胞传代


细胞在培养过程中不断增殖,培养皿/瓶空间有限,当细胞接触过密,生长就会受到抑制,影响细胞状态,因此我们要把其中一部分细胞分到别的培养皿/瓶,使细胞能够持续扩增。

细胞传代可以帮助我们扩大细胞培养的数量,同时也避免了因细胞进入平台期乃至衰亡期而大量死亡的窘境。

2.一般细胞传代流程&注意事项

No.1 材料准备

仪器

①离心机 ②水浴锅 ③酒精灯 ④超净工作台

溶液配制

①PBS液 ② 0.25 % 胰蛋白酶 ③基础培养基 ④胎牛血清

No.2 传代前准备

(1)预热培养用液:把已经配制好的装有培养液的瓶子放入37℃温箱/洁净水浴锅内预热,用酒精棉球擦拭好后放入超净台内;

(2)75%酒精擦拭超净工作台消毒、紫外线照射30min;

(3)在超净工作台中按次序摆放好无菌的移液器、移液管、离心管、巴斯德管、培养瓶等;

(4)75%的酒精擦拭双手消毒;

(5)点燃酒精灯:注意火焰不能太小,注意酒精量不能超过瓶身的2/3。

No.3 实验步骤

(1)从培养箱内取出细胞:注意取出细胞时要旋紧瓶盖,用酒精棉球擦拭显微镜的台面,再在镜下观察细胞;

(2)在超净工作台内将各瓶口一一打开,同时要在酒精灯上烧口消毒,保证细胞瓶的开口朝向酒精灯方向并保持10cm距离防止明火扰乱气流杂质落入培养体系;

(3)小心吸出旧培养液,加3ml无菌PBS后盖上瓶盖,轻轻摇动细胞瓶冲洗细胞,倒弃;

(4)根据培养瓶的大小加入适量的胰蛋白酶,根据不同细胞选择不同消化条件,一般最佳消化温度是37 ℃,但是易消化的细胞要注意消化时间避免过度消化;

(5)显微镜下观察细胞:倒置显微镜下观察消化细胞,若胞质回缩,细胞之间不再连接成片,表明此时细胞消化适度(注:若细胞叠层生长可先用少量胰酶将叠层细胞消化下来,再对底层生长均匀的细胞进行正常的消化操作,正常细胞避免二次消化);

(6)加入2倍体积的完全培养基(含血清)中止胰蛋白酶的作用,用巴斯德管/移液管/吸头等将已经消化细胞吹打成细胞悬液;

(7)将细胞悬液吸入15 ml离心管中;

(8)平衡离心:平衡后将离心管放入台式离心机中,以1000rpm/min离心5分钟;

(9)弃上清液,加入新培养液:弃去上清液,加入2 ml培养液,用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬液;

(10)分装:将细胞悬液吸出分装至2-3个培养瓶中,加入适量培养基旋紧瓶盖。

(11)用酒精棉球擦拭培养瓶,适当旋松瓶盖,放入CO2培养箱(推荐使用瑞沃德 D180-P二氧化碳培养箱)中继续培养。1.5~2小时左右开始沉降并贴附在瓶壁上。

No.4 注意事项

(1)正确摆放使用的器械:保证足够的操作空间,不仅便于操作而且可减少污染;

(2)倒置显微镜下观察细胞量,必要时进行细胞计数。密度过小会影响传代细胞的生长,传代细胞的密度应该不低于5×105/ml;

(3)在每一个培养瓶做好标记,至少包括细胞名称、细胞代数、接种日期、接种人;

(4)部分传代细胞(如PC12细胞), 少量的胰蛋白酶不影响细胞的生长,故可跳过实验步骤 (7)-(9);

(5)严格的无菌操作;

(6)适度消化:消化的时间受消化液的种类、配制时间、加入培养瓶中的量等诸多因素的影响,消化过程中应该注意培养细胞形态的变化,一旦胞质回缩,连接变松散,或有成片浮起的迹象就要立即终止消化。

3. 常见操作问题&解答

Q:贴壁细胞传代如何使用胰酶?

A:一般使用trypsin-EDTA浓度为0.25%trypsin-0.53mMEDTA.2Na或0.05%trypsin-0.02 mM EDTA.2Na。消化液浓度过高时,易造成培养基中细胞碎片增多,黑渣增多,常规细胞传代时建议用0.05%的胰酶进行消化,对于难消化的细胞可采用0.25%胰酶进行消化,细胞密度过高超过80%时,采用分步消化法。胰酶储存在–20°C,解冻在4°C进行,第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中,保存于–20°C,避免反复冷冻解冻造成trypsin活性降低,并可减少污染机会。

Q:如何控制胰酶消化时间?

A:胰酶消化的程度是细胞培养中的一个关键步骤:消化过度,严重影响细胞活性,并有部分细胞漂浮,随弃去的胰酶流失;消化不足细胞难于从瓶壁上吹下,反复吹打同样也会损伤细胞活性。

不同细胞对消化液的敏感性不同,胰酶消化的时间也会有差异。胰酶消化时间与胰酶的浓度,是否含EDTA,胰酶的储存时间,胰酶的储存温度,是否反复冻融,消化加入的胰酶体积,消化温度及细胞的密度等有关。对于新购买的细胞,建议客户先用低浓度的胰酶仔细去摸索一下消化时间,可每隔1分钟镜下观察细胞是否变圆,记录最佳消化时间,下一次操作参考之前的记录来控制时间即可。

Q:贴壁细胞如何进行传代?

A:去掉原培养瓶里面的培养基,加3-4ml PBS洗1-2次;弃PBS,再加1.5ml的Trypsin-EDTA (1X)消化液消化细胞,显微镜下观察,待细胞变圆,细胞间隙明显,部分细胞刚开始脱离瓶壁,加4ml左右完全培养液混匀终止消化,将细胞小心吹打下来,1000 rpm/min室温离心5min;弃上清,细胞沉淀用完全培养液重悬,按要求分瓶(视细胞密度而定1:2-1:3,1:3-1:6,1:6-1:8),每瓶补足培养基至5-6ml,37℃、5%CO2孵箱培养。

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