成年斑马鱼体内成像揭示：成熟少突胶质细胞分裂

摘要：几十年来，成熟少突胶质细胞 (mOL) 是否参与髓鞘再生一直存在争议。 最近，一些研究表明，mOLs 通过产生新的鞘参与髓鞘再生。然而，mOLs 是否可以通过不对称分裂产生新的少突胶质细胞尚未得到证实。与其他物种相比，斑马鱼是研究髓鞘再生的完美模型。在这项研究中，视神经挤压不会导致局部 mOLs 死亡。将视神经从 olig2:eGFP 鱼移植到 AB/WT 鱼后，来自供体的 olig2+ 细胞在受体中定居并重新包裹轴突。在移植后 3 个月将这些重新包裹的 olig2+ 细胞鉴定为 mOL 后，体内成像显示 olig2+ 细胞增殖。此外，在视网膜内还捕获了来自 mOLs 的新 olig2+ 细胞分裂的体内成像。 最后，在完成再髓鞘化程序后，良好的视觉功能得以恢复。总之，体内成像结果显示，成年斑马鱼的mOLs通过不对称分裂产生了新的olig2+细胞，这突出了mOLs在哺乳动物中枢神经系统的再髓鞘化过程中的作用。

背景：多发性硬化症 (MS) 是一种慢性自身免疫性疾病，其组织学特征是在中枢神经系统 (CNS) 中形成脱髓鞘和髓鞘再生斑块。设计有效的髓鞘再生增强疗法的先决条件是详细了解髓鞘再生如何发生的分子和细胞机制。成年动物的髓鞘再生是发育过程中髓鞘形成的再现，其中少突胶质祖细胞 (OPC) 是髓鞘再生细胞的主要来源。这一假说支持OPCs占成人大脑所有细胞的5-8%，即OPCs出现在MS患者斑块区域髓鞘恢复之前，OPCs移植到成人大脑有利于髓鞘再生和功能恢复。转基因小鼠体内研究支持NG2阳性OPCs能够增殖并维持OPCs平衡的假说。然而，最近的研究重新激活了mOLs主要参与髓鞘再生的理论。移植分选的MOL在体内外均能产生有髓少突胶质细胞。在成年小鼠重组 MOG 诱导的 EAE 模型中，mOLs 保持完整，尽管它们的髓鞘被剥离。在局灶性脑缺血模型和脊髓脱髓鞘模型中，mOLs 存活并重新生长到病变区域。来自两个大型动物脱髓鞘和髓鞘再生模型的结果，其中猫被喂辐照食物，恒河猴被喂去维生素B12的食物，这也支持这样的观点：即存活的 mOL 可以通过将新过程扩展到鞘脱髓鞘轴突来参与髓鞘再生。随后，该小组还评估了多发性硬化患者少突胶质细胞的生成，发现大多数患者未能在外观正常的白质中生成新的少突胶质细胞，而新生成的少突胶质细胞在阴影斑块中的存在微乎其微。出乎意料的结果表明，人类的髓鞘再生是由旧的幸存的少突胶质细胞而不是新的少突胶质细胞进行的。这些研究提供了一种替代模型，其中幸存的受损少突胶质细胞产生新的髓鞘，参与 MS 诱导斑块区域的髓鞘再生。然而，另一种可能的途径取决于髓鞘再生过程中的 mOL 增殖是否被认为是不可能的。考虑到mOLs是完全分化的细胞，在CNS中迁移能力较弱，大多数人认为髓鞘再生过程中mOL的分裂可以忽略不计。虽然体外研究表明mOLs在外界因素的刺激下可以重新进入细胞周期，但研究也表明少突胶质细胞在体内可以完整地进行有丝分裂。保持增殖能力的完全分化细胞的一个例子是低等脊椎动物视网膜中的 Müller 细胞。这些细胞扮演干细胞的角色，通过不对称分裂途径在视网膜内产生各种细胞。mOL 是否参与细胞分裂的髓鞘再生进程？为了确定 mOL 是否参与髓鞘再生，我们通过在成年斑马鱼中的实时体内成像研究了 mOL 增殖。在这里，利用转基因品系和成年斑马鱼的视神经髓鞘再生模型，我们发现局部mOLs在视神经挤压模型中存活并在移植后3 个月成熟时增殖。此外，在炎症因子的刺激下，视网膜内的不对称 mOL 分裂也被体内成像捕获。 我们的结果提供了 mOLs 确实可以在体内分裂的第一个直接证据，这将引起我们对揭示mOLs在哺乳动物中枢神经系统再生中的作用的兴趣。

视神经损伤后远端少突胶质细胞存活并增殖：为了研究视神经压伤后少突胶质细胞的命运，我们在受伤后第一天观察到远端残端的髓鞘塌陷，发现髓鞘碎片在 7 dpi 被侵入的小胶质细胞/巨噬细胞吞噬。在 7 dpi 也观察到髓鞘再生的开始，这表明远端节段的少突胶质细胞会在视神经损伤后存活。 接下来，我们计算视神经中olig2+细胞的数量。结果显示少突胶质细胞在7 dpi前丢失，但在14 dpi重新出现。在远端残端，整个时期都存在olig2+细胞。 在 14 dpi 时，远端区域的 olig2+ 细胞数量大于近端区域的数量，这表明该阶段少突胶质细胞增殖。由于p-erk1/2被认为是少突胶质细胞存活和增殖的特异性标志物，我们检测了其在视神经中的表达，发现在5dpi时，远端大部分olig2+细胞呈p-erk1/2阳性。统计结果显示远端残端p-erk1/2+与olig2+细胞的比例大于近端。蛋白质印迹分析还表明，p-erk1/2 在 5 dpi 时远端残端的表达显着高于近端残端。 所有这些结果表明，成年斑马鱼视神经损伤后少突胶质细胞存活并增殖。

来自供体视神经的 mOLs 参与宿主鱼的髓鞘再生：为了研究局部 mOL 是否可以成为新形成的少突胶质细胞的资源，我们将成年 olig2:eGFP 鱼的视神经节段移植到成年 AB/WT 视神经的间隙中。宿主视神经中的一些 olig2+ 细胞在移植后第 5 天 (dpt) 产生了两个细胞核。在移植后 3 个月 (mpt) 时，olig2+ 细胞已散布在宿主的整个视神经中，并保持与 mOL 相似的状态。为了确定这些 olig2+ 细胞是否是 mOL，我们进行了 MBP 染色，发现这些 olig2+ 过程与 MBP 共定位。另外，RGC轴突在纵切面被olig2+突起包裹。在横切面上，在生物素标记的再生轴突周围观察到olig2+髓鞘突起。这些结果表明，来自成年斑马鱼视神经的局部 mOLs 可以存活并参与髓鞘再生进程。

视神经损伤后少突胶质细胞存活。

体内成像检测视神经中局部少突胶质细胞的增殖：移植的 mOL 如何参与髓鞘再生？ 它们是分化成 OPCs 还是直接产生新的 OPCs？为了回答这些问题，我们利用olig2+细胞在3mpt时沿宿主视神经零星分布的特点，观察了活体移植视神经的局部mOL 分裂。第一帧图像中只有两个olig2+细胞。根据少突胶质细胞的复杂形态，其所有突起与视神经平行。我们相信这些细胞与图2d-k中的细胞相似。在第三帧（图3c）中，突然从右侧olig2+细胞的胞体中分离出一个附属物，之后它迁移到更深的空间（从第五帧到第十二帧），最后脱离成像焦点。我们获得了同一动物中 olig2+ 细胞分裂的更多细节。 在细胞分裂之前，胞体的荧光被浓缩，髓鞘过程保持完整。三分钟后（即第五帧到第七帧），细胞质的下部向左侧迁移，形成一个附着在胞体上的小附属物。附属物一直向左移动，然后在第九帧中与躯体完全分离。移植olig2+细胞可以重新包裹再生轴突后，我们的活体成像结果证实视神经中的局部少突胶质细胞可以直接参与再髓鞘化进程。

来自供体成年斑马鱼的mOLs在3 mpt时重新包裹宿主鱼的轴突。

体内成像显示视网膜内的 mOLs 以不对称的方式产生新的 OPCs：

为了获得更高质量的体内 mOL 分裂成像，我们专注于视网膜内的少突胶质细胞。之前的结果表明，视网膜中的髓鞘与 MBP 抗体共定位并具有 Ranvier 节点结构，这意味着成年斑马鱼视网膜中存在 mOL。此外，图 4b 显示视网膜内的 olig2+ 细胞显示出完美的 mOL 形态。为了确保较高的体内 mOL 分裂成像机会，我们每 4 h 向 olig2:eGFP 鱼的正常眼睛注射 5 μg/ml TNFα 溶液。第三次注射后，我们成功地观察到体内 mOL 分裂（2/12 条鱼）。如图 4a 中的箭头所示，mOLs 的过程在整个成像期间保持其完整性。7.5 min时，胞体出现分裂，14 min 3 s分裂完成。 在 23 min 33 s，新生的 olig2+ 细胞从母细胞移动了 27.4 μm。由于子细胞与母细胞胞体直接不对称分裂，我们计算了母细胞或子细胞中心与参考点之间的位移。结果表明，子细胞的位移明显大于母细胞的位移。前半小时子细胞的平均速度为95.9 ± 46.3 μm/h（n= 3），明显高于母细胞。为了确认成年斑马鱼体内的 mOL 是否可以以不对称的方式直接产生新细胞，我们使用 BrdU 来标记那些处于分裂状态的 mOLs。该 mOL 的细胞核（图 4h）已包含 BrdU（图 4g）。据我们所知，这是第一项在体内捕获成年脊椎动物 mOL 分裂的研究。

移植视神经局部少突胶质细胞增殖的影像学研究。

视网膜内的 mOL 以不对称的方式分裂。

视神经挤压模型中髓鞘结构完全恢复：

上述结果表明，局部mOLs可以产生新的OPCs。为了确定成年斑马鱼视神经损伤后髓鞘再生何时完成，我们通过免疫组织化学和 TEM 检查了髓鞘结构。 图 5a-c 显示MBP 信号在 7 dpi 时消失，并在 21 dpi 时重新出现。挤压部位与近端残端MBP强度比值在14 dpi前显著下降，21 dpi时略有恢复，28 dpi时达到正常水平。我们用 nav1.6 抗体标记钠通道以研究视神经损伤后 Ranvier 节点的恢复。Ranvier淋巴结密集散在正常视神经的视束中。在视神经损伤的早期，随着轴突退化，Ranvier 节点消失。7dpi时，远端节段可见nav1.6的线性分布，提示再生轴突未被少突胶质细胞覆盖。在伤后3周，大部分 Ranvier 节点已经恢复，统计结果显示与正常组无显着差异。在TEM观察下，我们分析了损伤后不同时间的髓鞘厚度。 在正常视神经中，轴突周围的髓鞘是致密的。7dpi时，脱髓鞘完成，大部分再生轴突裸露。21dpi时再生轴突髓鞘逐渐恢复。髓鞘指数结果显示，髓鞘厚度在 9 wpi 时完全恢复。

髓鞘再生完成后视功能恢复

结论：斑马鱼是髓鞘再生的完美体内成像模型。体内成像结果直接表明，新的 OPCs 与视神经和视网膜内局部 mOLs 的胞体不对称地分开。 这些发现将突出 mOLs 在哺乳动物中枢神经系统髓鞘再生过程中的作用。

原文出自：In vivo imaging reveals mature Oligodendrocyte division in adult Zebrafish | SpringerLink