长期以来，非人灵长类动物（non-human primates，NHPs)一直被用于开发和测试针对人类疾病的疫苗。近期为应对COVID-19大流行，科研领域对NHPs的需求明显增加。国际上，对NHP使用和护理有很高要求，一方面是出于动物福利和伦理的考虑，另一方面是为了保障疾病模型的有效性和研究数据的质量。NHP研究的资助者也越来越重视3Rs原则（减少、替代和优化），以确保研究是合法的、合乎伦理的和高质量的。

近日，国际期刊Vaccines上发表了题为“Opportunities for Refinement of Non-Human Primate Vaccine Studies”的综述。文章由英国国家3Rs中心 (NC3Rs)和流行病防范创新联盟(Coalition for Epidemic Preparedness Innovations, CEPI)研究人员共同发表，这两家组织开展合作支持疫苗研发人员落实3Rs原则。文章详述了在他们联合召开的国际研讨会上专家对疫苗研究中使用NHPs达成的共识。当代NHP实验的良好规范需满足社会化饲养、丰荣、配合训练、实施人道终点和支持性护理。不可否认，开展高致病性病原体研究所要求的高水平生物防护给落实3Rs原则带来很大挑战，但不是不可克服的。

社会化饲养。众所周知，社会化饲养对NHPs福利至关重要，大量文献证明单独饲养对高度社会性动物的心理健康有严重危害。但“用于传染病研究”是往往是IACUC认为可以接受NHP单独饲养的理由。要注意的是在英国，这并不是合理的豁免理由。在英国，用成对饲养或群体饲养的NHPs进行疫苗效力的研究已被FDA认可。研究显示社会化饲养对缓解动物压力和增强免疫反应有显著作用，该动物模型可能更有代表性。专家的共识是在攻毒之前，NHPs都应群体饲养。针对该类研究，建立和维护能和谐相处的群体、盲法研究和采集测量指标都有相应的方法。

笼具和丰荣。在复杂的环境中饲养NHPs，为它们提供必要的锻炼和社会互动的机会是实验室通常的做法。但在高水平生物防护条件下开展的研究，往往不会为NHPs提供这样的环境。文章指出在攻毒实验开始之前，如疫苗接种阶段，应让动物生活在满足福利要求的环境中。英格兰公共卫生局（Public Health England，PHE）开发了先进的安全围护系统。在实验所有阶段，该系统均可在确保人员安全的同时满足NHPs空间、环境和社会互动的需求(图1)。此系统已被用于研究多种病原体，包括SARS-COV-2。在已有设施的结构无法安置更宽敞的笼具的情况下，可对现有笼具进行定制改造以满足福利要求，如移除侧板连接和组合其他的笼具。

图1 PHE成组饲养恒河猴的笼具。图中显示了3个笼子，每个笼子包括4个单元。（图.Make Dennis）

配合训练和镇静。仅对动物进行物理保定就开展高致病性病原体操作风险是很大的。但研究人员也应清楚化学保定对实验的影响。研究发现氯胺酮可降低恒河猴和食蟹猴的细胞因子水平；还会降低非人灵长类动物每日食物摄入量，导致体重显著下降。文章指出无论是否使用镇静剂，NHPs都应接受配合训练，以适应高等级生物安全实验室环境和研究程序。这有利于动物福利的要求、降低操作人员暴露风险和获得质量更高、更稳定的研究数据。专家确定的良好训练操作包括: 使用正强化(如食物奖励)方法训练动物按照指令来到某个地方；配合肌肉注射镇静剂，以使拍摄X光、称重和测量体温等对临床评估至关重要的程序能在动物承受最小的压力下安全进行。绒猴7-10天内就被训练自主进入指定笼具；训练动物坐在体重秤上或称量桶里(适合小体型NHPs，如狨猴)；从注射器中吸取液体；通过转移训练帮助动物适应“新的”生物安全实验室；与动物互动是为了让它们熟悉实验人员全副防护装备的外观和行为，同时也使人能够了解每只动物以及它们的行为；最后，研究人员应将动物训练纳入实验方案。

    人道终点。研讨会专家一致认为，研究开始前就要确定人道终点指标，按照一定频率监测动物状态，避免动物遭受严重痛苦和自发死亡。人道终点除了能降低动物痛苦，还可降低生物样本地降解，并将与感染无关的对疾病发展和动物死亡的不利影响（如无法获得食物）降至最低，后者会使判断病原体致病性复杂化。感染病模型常用的人道终点指标包括但不限于体温、食欲不振、体重减轻、反应迟钝以及/或躺卧。不同病毒、同一病毒的不同毒株、接种途径和剂量等都会影响指标制定。随着数据增加，人道终点应持续改进。遥测技术是一项有效但尚未在NHP传染病研究中得到广泛应用的技术。该技术可提供准确、客观的数据包括体温、血压、心电图和心率、呼吸频率和活动水平等。在一项研究中，疾病早期的发烧被用作抗生素治疗的指标，病程后期持续监测到体温过低则为人道终点的指标，在动物体内植入了遥测装置监测核心体温使指标监测更便利。

支持性护理。提供支持性护理（如补充液体和减轻疼痛）是重要的人道方法，也是IACUC期望研究采用的优化方法。接种疫苗的动物在进入攻毒阶段前应是健康的，所以在疫苗接种阶段出现特发性脱水或腹泻的动物在兽医监护下，可给予液体和普通药物以缓解症状。以是否影响疾病结果为判断标准，提供软或湿的食物、新鲜水果蔬菜、冰块、口服补液或将水瓶移到不能活动动物的旁边等操作是允许的；但某些兽医治疗，如免疫抑制剂，在攻毒阶段可能是禁忌。在研究开始前充分讨论和确定支持性护理方案，同时考虑该方法是否有效和是否会干预疾病进程或人道终点的识别。

文章最后呼吁研究人员、兽医、技术和生物安全人员、监管人员、资助者共同努力优化现有的做法并迎接挑战。在高水平生物安全实验室安全仍然是首要考虑因素。CEPI与符合NC3Rs标准和高监管标准（如GLP）的首选实验室签订合同，将对实验室基础设施和人员培训进行投资，以帮助实验室实现所需的目标。最终，CEPI与欧盟的几家动物研究机构签订合同，在BSL-3/4实验室配备新的用于动物遥测、体积描记术和活动监测的设备，扩充了这些实验室收集的数据。在美国，CEPI与匹兹堡大学签订合同为其NHP饲养笼升级，安装了向外扩展的笼具以允许社会化饲养并接近欧盟标准。在疫情早期完成的这些实施设备改进，已经为符合3Rs原则的COVID-19疫苗研发作出贡献。 

参考资料：

1. https://www.mdpi.com/2076-393X/9/3/284/htm

2.https://www.nc3rs.org.uk/news/refining-non-human-primate-vaccine-studies-age-covid-19