想调整研究方向，获得学术研究突破口？想获得论文选题思路，提高发文命中率？你需要了解学科发展态势和未来走向！赛业生物专栏《Gene of the Week》每周二会根据热点研究领域介绍一个基因，详细为您介绍基因基本信息、研究概况和应用背景等，助您保持学术研究敏锐度，提高科学研究效率，期待您的持续关注哦。今天我们要讲的主角是淋巴细胞V(D)J重排缺一不可的基因——Rag1、Rag2。 

Rag1、Rag2简介

我们知道，B细胞产生的免疫球蛋白（Ig）—— B细胞表面受体（B cell receptor, BCR）和抗体，以及T细胞上的T细胞表面受体（T cell receptor, TCR）都具有特异性：一种Ig或TCR蛋白只能特异性地识别一种抗原。但总体上，这些蛋白具有庞大的多样性，而这个多样性是依靠V(D)J重排（recombination）达成的。V(D)J重排是脊椎动物早期T细胞和B细胞发育成熟过程中的体细胞重组机制，通过对可变区（variable，V）、多样区（diversity，D）和连接区（joining，J）基因的重新组合，产生识别不同抗原的多样化Ig和TCR。而重组激活基因（recombination-activating genes，RAGs)：Rag1和Rag2，分别编码了Rag1和Rag2重组酶（recombinases）。Rag1和Rag2限制性表达在发育中的淋巴细胞中，是适应性免疫系统的重要组成部分。 

12/23规则

Ig和TCR的胚系基因（germ line gene）中的V、D、J区域的两端都存在重排信号序列（recombination signal sequence，RSS）。结构上来看，RSS的一端有一个7bp的序列（heptamer），另一端则是一个9bp的序列（nonamer），两者间夹着一个12bp或者23bp的spacer序列，因此RSS可以分为两种：含12bp spacer的12-RSS，以及含23bp spacer的23-RSS（图1a）。12/23规则是指：在V（D）J重排时，12-RSS只能和23-RSS结合，从而保证基因片段的正确连接。举个例子，在Ig重链（IgH）的胚系基因中，VH和 JH基因的两侧都是23-RRS，而 DH基因的两侧是12-RSS，因此12/23规则可以防止VH和 JH基因的直接连接，确保DH基因也参与到重排中（图1b）。此外，从分子水平上看，12-RSS和23-RSS结合也能形成更稳定的突触复合物（synapsis）。 

在V(D)J重排过程中，首先，Rag1/2复合物在高迁移率族蛋白B1(high mobility group box 1，HMGB1)的帮助下（辅助DNA结合），识别并结合12-RSS或23-RSS，在RSS的heptamer和编码端的交界处精准地引入一个单链切口。切口使编码端的末端产生一个游离的 3'-OH 基团，这个基团随后攻击反向平行链中的磷酸二酯键，形成发夹结构（hairpin）以及一个钝性的信号端。信号端保持与RAG1/2复合物的结合，构成一个“post-cleavage complex”的暂时性结构。随后，编码端和信号端均经过非同源末端连接（non-homologous end joining，NHEJ)通路进行加工与连接，形成编码区连接（coding joint）和环化的信号区连接（signal joint）（图1c）。

图1. V(D)J重排[1]

(a) RSS结构：12-RSS与23-RSS：7bp的heptamer和9bp的nonamer之间分别夹着12bp的spacer或23bp的spacer。

(b) RSS 在人IgH、IgK、IgL、以及TCR α链、β链、γ链和δ链基因上的分布。(c) V(D)J重排机制。 

Rag1、Rag2的区别

那Rag1和Rag2有什么功能上的区别呢？Dr. Akamatsu的实验显示，在RSS和非特异性DNA序列存在的情况下，Rag1与RSS的结合仅比与非特异性DNA序列高3~5倍。而Rag2方面，实验观测不到其与DNA的结合；但当Rag1和Rag2同时存在的时候，它们能与DNA形成Rag1-Rag2-DNA复合物，这个复合物比 Rag1-DNA 复合物更稳定、更具有特异性，并且在 V(D)J 重组中具有切割活性。这些结果说明在V(D)J重排中，Rag2可能起到辅助Rag1与DNA识别的作用，有效结合与识别RSS需要Rag1和Rag2的同时存在[2]。 

小结

Rag1和Rag2重组酶都是T、B细胞发育成熟和产生免疫球蛋白的关键蛋白。在V(D)J重排中，Rag1/2复合物参与了对RSS的识别与剪切。因此，与携带PrkdcSCID基因突变的小鼠相比，Rag1和Rag2敲除的小鼠由于其V(D)J重排通路从源头受阻，因此，小鼠缺乏功能性T、B淋巴细胞，也不会发生免疫泄露（“leakiness”），即小鼠体内产生少量的有功能的T、B细胞和免疫球蛋白。不同遗传背景的SCID小鼠中免疫泄露的发生率不同：一般来说，SCID小鼠在C57BL/6J 和BALB/c 背景上的泄漏率高；在C3H背景上较低；而在NOD背景上极低。但目前，产生免疫泄露的分子机制仍不明确。 

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BRGSF重度免疫缺陷鼠助力肿瘤免疫研究

Scid小鼠由于Prkdc基因的突变对射线敏感，BRGSF小鼠在保证B细胞和T细胞失活的前提下（敲除Rag2基因），具有较高的辐照耐受性，适合评估体内辐射治疗的效果及人源化小鼠的构建。 

品系说明：

☑ 缺乏成熟的T、B、NK细胞，巨噬细胞吞噬功能受抑制、髓系细胞发育受损，是目前市面上免疫缺陷程度最高的小鼠之一。

☑ Scid小鼠由于Prkdc基因的突变对射线敏感，而BRGSF小鼠在保证B细胞和T细胞失活的前提下（敲除Rag2基因），具有较高的辐照耐受性，适合评估体内辐射治疗的效果及人源化小鼠的构建。

☑ NOD背景来源的Sirpα基因（SirpαNOD）取代了BALB/c背景来源的Sirpα基因，小鼠巨噬细胞对人源细胞的吞噬作用弱，对各种来源的CDX和PDX高度兼容。

☑ Flk2的敲除使小鼠髓系细胞组分（特别是DC）大幅减少。

☑ 补体系统功能健全，是研究补体依赖的细胞毒性（CDC）的有力工具。 

研究应用：

☑ CDX和PDX建模。

☑ 髓系细胞发育研究。

☑ 疫苗研发。

☑ 细胞免疫疗法的有效性和安全性评估（例如CAR-T）。

☑ 抗体药物药效评价（例如在BRGSF小鼠上移植人PBMC或HSC，在人免疫系统重建后接种肿瘤，进行抗体药物相关研究）。

☑ 构建人免疫系统重建小鼠模型，例如人CD34+ HSC移植。 

除了以上免疫缺陷小鼠外，赛业生物模式动物创新药物研发平台还可以根据您的需求提供各种有效的肿瘤研究模型，如传统免疫缺陷鼠BALB/c nude（裸鼠）、NDD scid小鼠、C-NKG重度免疫缺陷鼠、免疫检查点人源化小鼠、肿瘤细胞系移植模型、人源肿瘤组织异种移植模型（CDX）、基因修饰模型及表型分析服务等。我们可以构建各类皮下、原位或者转移瘤模型，并针对相应的模型提供高度定制化的体内药效学服务，以满足您的需求。如有需要，欢迎联系我们~

☑ 基因编辑大小鼠肿瘤模型

☑ 传统免疫缺陷小鼠（BALB/c nude、NOD scid）

☑ 重度免疫缺陷小鼠（BRGSF、C-NKG）

☑ 人免疫系统重建小鼠（BRGSF-HIS）

☑ 同源肿瘤移植模型（Syngenic）

☑ 人源肿瘤细胞系异种移植（CDX）模型

☑ 单免疫检查点人源化小鼠（hPD-1、hCTLA-4、 hGITR、 hVISTA......)

☑ 双免疫检查点人源化小鼠（hPD-1 & hVISTA、 hPD-1 & hCTLA-4、 hCTLA-4 & hLAG3） 

参考文献：

[1] Nishana, M., & Raghavan, S. C. (2012). Role of recombination activating genes in the generation of antigen receptor diversity and beyond. Immunology, 137(4), 271–281.

[2] Akamatsu Y, Oettinger MA. (1998). Distinct roles of RAG1 and RAG2 in binding the V(D)J recombination signal sequences. Mol Cell Biol, 18(8):4670-8.