病毒载体包装过程是复杂的，在做病毒包装实验中，科研工作者常遇到一些问题。为了让大家在病毒包装这块少走弯路，《细胞基因编辑小课堂栏目》特邀赛业生物细胞生物学产品经理针对病毒包装常见的问题为大家进行经验总结与心得分享。有同学留言说想看腺相关病毒（Adeno-associated virus, AAV）包装，有求必应的小赛这就安排上！

Q1：AAV有哪些特性呢？

Q2：实现AAV在动物体内表达需要注意哪些关键点？

1. 血清型的选择。AAV的血清型主要由AAV衣壳蛋白的结构所决定，不同的衣壳蛋白结构识别不同的细胞表面受体，因此血清型的选择会影响AAV的感染效率、组织亲和性、和开始表达的时间。 

2. 启动子的选择。是选择广谱性启动子还是特异性启动子。相比于血清型的组织特异性，特异性启动子可实现细胞的特异性，因此对特异性要求较高的研究，可以选择某种细胞特异性表达的启动子。 

3. 注射方式。对于可以进行局部注射的组织器官，采用局部多点注射靶器官可取得较好的特异性和表达效果。 

4. 病毒量及滴度。根据不同的靶器官组织和所使用的不同AAV血清型（扩散能力不同），推荐注射的AAV量不同，传递到组织中的病毒颗粒数量对于感染效果影响很大。但AAV使用量并不是越多越好，过多的量可能出现病毒溢出，而且根据我们的经验，病毒量太多有时候甚至会出现表达降低的情况。想了解具体组织的病毒用量可以联系我们咨询。 

5. 检测时间。不同基因的表达高峰时间是不同的，再加上AAV需要从单链DNA变成双链DNA，一般在2周可检测到基因表达，如无抗体产生的影响，基因的表达可持续表达半年以上。 

Q3：为什么很少用AAV做细胞感染？

主要是因为AAV转染细胞的表达效率较低，且由于AAV是单链DNA，进入细胞后须经历一个由单链变成双链的过程才能进行转录翻译，而在没有辅助病毒或辅助因子的情况下，这种单链DNA复制形成双链DNA的过程十分缓慢，因此存在表达延迟的情况。 

另外，体外细胞的生长速率较快，感染至细胞中的AAV会随着细胞分裂不断稀释，进一步导致其表达水平降低。而在体内研究，注射的组织细胞通常不会有那么快的增殖，且各种AAV所携带的外源基因表达的因子较为丰富，因此表达丰度和持续的时间更好。 

Q4：如何通过AAV实现体内的特异性表达？

由于目的基因在不同组织中功能不同，以及同一组织的不同细胞中功能也可能不同，所以我们实验过程中经常需要进行特异性表达。AAV可通过以下几种方式实现体内的特异性表达： 

1. 组织特异性血清型。不同血清型的AAV具有不同的组织嗜性，因此首先要选择对特定组织感染能力强的血清型AAV。 

2.（细胞）特异性启动子。血清型主要利用侵染特异性，而启动子则是利用表达特异性，如某种特异性启动子AAV2，可侵染多种组织，但仅在某特定细胞表达。 

3. 局部注射。此外还可采用Cre依赖性基因开关（Cre-loxp系统），如用特异性启动子含cre酶的AAV注射Loxp小鼠实现特定组织或细胞目的基因的敲除。 

Q5：AAV作为一种体内常用的工具病毒，可实现什么功能？

1. 基因过表达。将目的基因的CDS区构建到AAV载体，注射到动物体内实现过表达。 

2. 基因干扰表达。将针对目的基因设计的shRNA构建到AAV载体，注射到动物体内实现干扰表达。 

3. 目的基因的敲除。将针对目的基因设计的gRNA和Cas9编码序列分别构建到AAV中，注射到动物体内实现基因敲除。 

4. 内源过表达。将针对目的基因设计的gRNA和dCas9分别构建到AAV载体，实现内源过表达。 

Q6：AAV感染后荧光弱？

荧光弱主要有2方面的原因，一是组织感染的效率较差，另外就是检测的正确性。对于提高感染效率，则从病毒血清型是否合适、病毒使用量是否够、滴度是否合适，注射方法是否合理等方面进行分析；而对于检测，在组织样本切片制备的过程中，应考虑荧光蛋白的稳定性，如GFP遇酸容易淬灭等因素，从而确保检测的有效性。 

另外，AAV病毒使用前需确认是否出现因储存不当而导致滴度下降的情况。 

Q7：AAV感染后过表达效果弱？

1. 病毒量不够：应充分调研高分文献报道，确定AAV滴度及用量，对于找不到参考文献的，也欢迎咨询我们。 

2. 载体表达效率低：更换启动子或增加强调控元件。 

3. 细胞负反馈机制：少数基因受上下游严格调控，这种情况较难实现过表达。 

4. 基因序列本身的元件：例如GC含量、隐蔽性剪接位点、转录终止信号和核酸二级结构等，也可影响表达。因此，密码子优化广泛用于增强AAV中目的基因表达。 

Q8：AAV的表达效果能维持多久？

AAV在细胞内主要是以环状的dsDNA附加体（circularised dsDNA episomes）的形式存在，而不会像慢病毒LV那样整合到宿主细胞的基因组。对于分裂不旺盛的细胞，如神经元，AAV可持续表达1年以上甚至2年，对于分裂较旺盛的细胞，一般也可维持3~6个月或以上。 

Q9：AAV的操作、使用安全性怎么样？

迄今为止，未发现野生型AAV有致病性，实际上大部分人群都感染过AAV。野生型AAV在无辅助病毒（如腺病毒）的存在下，复制效率非常低。重组腺相关病毒（rAAV）由多个质粒（cis质粒、辅助质粒、rep/Cap质粒）组成，且Cis质粒、辅助质粒与rep/Cap质粒之间不具有同源性序列，因此重组AAV在理论上不具有复制的能力。