食管鳞癌（ESCC）是我国高发的消化道肿瘤之一。临床上，ESCC的治疗主要以手术治疗，化疗，放射性治疗为主。尽管近年来，免疫治疗为ESCC的治疗带来新的曙光且治疗策略不断完善，但是ESCC患者的5年生存率仍不足20%。ESCC发病的分子机制尚未完全阐明，发现ESCC在发生发展过程中起关键作用的分子以及探究其能否作为ESCC靶向治疗的潜在分子靶点是目前有待研究的重要方向。

癌症化学预防是在癌变的早期，利用毒性较低的天然或合成的化合物通过干预癌细胞内参与癌症发生发展的分子相关事件来预防、抑制或逆转癌症发生的重要策略。因此，将癌症化学预防策略运用到ESCC术后患者身上从而预防ESCC的术后复发显得尤为重要。

整合素αv （integrin αv, ITGAV）是纤连蛋白的受体，与整合素β1、3、5、6和8可形成异源二聚体。配体与整合素结合可促进许多蛋白激酶（包括FAK和SRC）及其下游分子的激活。激活ERK/JNK和PI3K/AKT信号转导通路，对细胞增殖、迁移和存活至关重要。研究表明ITGAV在多种肿瘤中表达量升高，其中包括食管癌、黑色素瘤、肺癌和前列腺癌。迄今为止， ITGAV 抑制剂的临床试验并未达到显著的抗肿瘤效果，因此迫切需要开发新的有效的抗肿瘤整合素抑制剂。

图1. ITGAV在ESCC组织中比癌旁组织表达水平高。（A） 对ESCC组织芯片进行IHC染色检测ITGAV表达。（B） ESCC组织与食管正常组织中ITGAV表达水平统计。（C） ESCC成对组织样本中ITGAV表达水平统计。***, P < 0.001。 

研究材料

ESCC细胞系、裸鼠、CDX模型、PDX模型、NOD-SCID免疫缺陷小鼠、BRGSF重度免疫缺陷小鼠等。 

技术方法

1. 通过从UALCAN网站下载TCGA数据库分析比较整合素蛋白家族基因在ESCC与正常对照组织中mRNA表达水平。 

2. 通过IHC染色和Western blot实验检测ITGAV在癌与癌旁组织及ESCC细胞系中的蛋白表达水平。 

3. 构建CDX、PDX小鼠模型，研究ITGAV在ESCC患者来源的肿瘤中的功能。 

4. 对FDA批准的药物进行了计算机虚拟筛选ITGAV抑制剂。并使用分子对接模型来验证虚拟筛选的结果。 

5. 通过RT-PCR实验、体外泛素化活性检测实验、Ubibrowser、IP实验、体外泛素化实验等进行机制研究。 

6. 使用MTT实验检测癌细胞生长的变化。使用流式细胞术进行分析吲哚美辛对细胞周期的阻滞作用以及对细胞凋亡的影响。通过Western blot实验检测G1期的蛋白表达情况。 

7. 通过构建ESCC PDX 、NOD-SCID免疫缺陷小鼠肿瘤复发模型、BRGSF小鼠人免疫系统重建模型以评估吲哚美辛对抑制ESCC复发、抗肿瘤免疫效应等影响。 

研究结果

吲哚美辛是一类非甾体类抗炎药，其抗炎机制是通过抑制COX，从而降低前列腺素的生成。COX是一个炎症发生过程中起关键作用的酶，COX酶能够把花生四烯酸代谢产物转化为前列腺素等导致炎症和疼痛的分子。近期研究报道，非甾体类抗炎药物在结直肠癌的治疗和预防上有显著效果。临床试验证实小剂量阿司匹林的服用可以有效降低卵巢癌，结直肠癌以及乳腺癌的风险。 

本研究通过TCGA数据库以及临床样本检测发现，跟正常组织相比，ITGAV基因的mRNA与蛋白的表达水平在ESCC组中显著升高，并且ITGAV的高表达跟ESCC患者的不良预后呈正相关。此外，本研究还发现吲哚美辛能够与ITGAV结合并促进SYVN1 E3泛素连接酶介导的ITGAV的泛素化降解。

图2. 吲哚美辛加强SYVN1介导的ITGAV泛素化。在HEK293T细胞里做ITGAV, UB, SYVN1共转染，并用MG132处理8h，质粒转染48h后，裂解细胞并加入Flag抗体对泛素蛋白的Co-IP实验。 

本研究构建了人源化异种移植瘤模型，验证了吲哚美辛能够抑制小鼠体内ESCC肿瘤的生长与复发。由于免疫治疗作为新兴的癌症治疗手段在临床上获得了突破性的进展与较好的疗效。因此本研究构建了人免疫系统重建模型验证吲哚美辛是否能够促进免疫细胞的抗肿瘤效果。 

该模型使用了赛业生物公司提供的BRGSF小鼠，该小鼠是一种重度免疫缺陷小鼠，被广泛应用于肿瘤学（比如肿瘤生长、转移、抗肿瘤药物筛选）、免疫学（比如免疫细胞发于增殖机制、免疫疾病发生机理）等研究领域。使用该小鼠构建的人源化免疫系统重建模型窗口期长、且未观察到明显的贫血现象或小鼠体重下降等现象。注射PBMC后的第23天人CD45阳性率达到30%以上。本研究结果发现，吲哚美辛能够抑制TGFβ/SMA2/SMAD3信号通路，从而促进肿瘤微环境中CD8⁺ T细胞的免疫应答。

图3. 人免疫系统重建模型。（A）人免疫系统建立流程图。（B，C）抽取PBMC注射组小鼠的血液进行流式细胞仪检测人CD45阳性率并绘制柱状图。

图4. 吲哚美辛促进免疫细胞的抗肿瘤反应。（A）小鼠接种PDX肿瘤一周后开始吲哚美辛处理并测量小鼠肿瘤体积，绘制肿瘤生长曲线。（B）动物实验结束后，取小鼠肿瘤并称量肿瘤重量后作图分析差异。（C）处死小鼠后，取小鼠体内肿瘤并拍照。

图5. 吲哚美辛促进人CD8⁺ T细胞增殖。采取小鼠血液并去除红细胞后进行抗体标记染色，使用流式细胞仪检测人CD3, CD8和CD4阳性率。**；P < 0.01。

总结

总的来说，本研究发现，ITGAV在ESCC中蛋白表达量显著高于癌旁组织，且与不良预后正相关。敲低ITGAV能够阻断FAK/PI3K/AKT信号通路从而抑制ESCC细胞的增殖以及肿瘤的生长。吲哚美辛能够与ITGAV直接结合并且促进E3泛素连接酶SYVN1介导的ITGAV泛素化降解。吲哚美辛能够抑制ESCC PDX肿瘤的生长与复发。吲哚美辛能够通过降解ITGAV导致TGFβ/SMAD2/SMAD3信号通路受到抑制，从而促进CD8⁺ T细胞分泌IFNγ并增强CD8⁺ T细胞的抗肿瘤免疫反应全文信号通路图及连接如下：