摘要：胶原蛋白是一种主要的细胞外基质成分，在维持鱼的肌肉生长和肌理方面起着关键作用。环境因素促进肌肉胶原蛋白沉积是提高鱼产品质量的有效途径。然而，温度作为水产养殖中的一个关键环境因素，对鱼类肌肉生长和胶原蛋白代谢的影响尚不清楚。我们以斑马鱼作为鱼类模型，研究了水温（18 ℃、28 ℃、34 ℃）对生长性能、肌肉结构和胶原代谢的影响。7周试验后，与对照组（28℃）相比，18℃和34℃组的肌纤维生长性能和密度均显著降低。低温组（18℃）肌肉胶原沉积明显增加。RNA测序和qRT PCR表明，随着温度的升高，胶原基因（col1a1a、col1a1b、col2a1b等）、调节胶原合成基因（tgf-β、ctgf）和降解基因（mmp2、mmp9、timp2等）的转录下调。此外，温度显著影响内质网（ER）途径的蛋白质加工。高温组前胶原分子伴侣（hsp47、p4hb、sec24a等）在该途径中的转录显著上调。值得注意的是，各组间羟脯氨酸含量无显著差异，表明胶原蛋白翻译后修饰（羟基化等）过程中可能存在温度补偿机制。结果表明，温度对斑马鱼的肌肉生长和胶原蛋白代谢有着深远的影响。在水产养殖过程中，适当的低温可以促进鱼肉中胶原蛋白的沉积。我们的数据将丰富鱼类胶原蛋白代谢调控机制的基础知识，并有助于制定生产高质量鱼产品的策略。

关键词：温度  斑马鱼  肌肉  胶原代谢

简介：胶原蛋白是结缔组织中主要的细胞外基质成分，占全身蛋白质含量的25–35%。它在肌肉生长和机械特性（肌肉结构的完整性/稳定性）中起着至关重要的作用。一般鱼的肌肉中胶原蛋白的含量为0.2-1.4%，是决定肉质的重要因素。研究表明，饲喂蚕豆或牧草的草鱼和饲喂羟脯氨酸的大黄鱼的胶原蛋白含量和肌肉质地性状同时得到改善。因此，通过环境因素（养殖条件、营养物质等）促进鱼肉中胶原蛋白的沉积将是改善水产养殖中鱼肉品质的有效途径，近年来受到了广泛关注。然而，鱼类胶原蛋白代谢的调节机制仍知之甚少。温度作为水产养殖中的一个重要环境因子，对鱼类的发育、生长、繁殖和代谢等生命活动有着深刻的影响。温度变化会影响斑马鱼和虹鳟鱼心脏胶原的沉积。然而，由于不同的生理功能，温度对骨骼肌（鱼类的主要可食用部分）中胶原蛋白代谢的影响是否与心脏相似，值得怀疑。此外，温度调节鱼类胶原蛋白代谢的分子机制尚不清楚。据我们所知，目前还没有研究温度如何影响骨骼肌中的胶原沉积及其潜在的分子机制的报告。斑马鱼是一种鱼类模型，已广泛应用于发育生物学、生态毒理学、水产养殖营养学等领域。鉴于其广泛的耐热性（6.7-41.7 ℃）和较小的体型，它可以方便地用于研究环境温度变化的影响。在目前的工作中，我们假设温度可能会影响斑马鱼体内的胶原蛋白沉积。因此，我们研究了水温对斑马鱼肌肉结构和胶原代谢的影响。 此外，进行了比较转录组分析以探索温度调节胶原代谢的潜在机制。我们的研究结果将为鱼类胶原蛋白代谢的调节机制提供新的见解。

温度对斑马鱼生长及近似组成的影响：在本研究中，不同温度处理的斑马鱼的存活率没有显著差异。与28℃饲养的斑马鱼（对照组）相比，34℃和18℃饲养的斑马鱼的最终体重和长度显著降低（P<0.05）。在接近成分方面，18℃饲养的鱼的粗蛋白和粗灰分含量分别显著低于28℃和34℃饲养的鱼。而与对照组相比，34℃组和18℃组鱼的水分含量不受影响。

图 1. 温度对斑马鱼生长和近似组成的影响。A) 适应18 ℃、28 ℃和34 ℃的鱼最终体长； B) 适应18 ℃、28 ℃和34 ℃的鱼的最终体重； C) 18 ℃、28 ℃和34 ℃组斑马鱼的近似组成。

温度对斑马鱼肌肉结构和胶原沉积的影响：进行肌肉横切面以研究温度对斑马鱼肌肉结构的影响（图2A）。与28 ℃相比，适应34 ℃和18 ℃的鱼的肌纤维平均直径显著增加。而34 ℃和18 ℃组的肌纤维密度显著降低。此外，温度显著影响肌肉发育和生长调控基因（myf6、myog、mef2cb、mb）的表达水平。

图 2、 温度对斑马鱼肌纤维特性的影响。 A) 适应 18 ℃、28 ℃ 和 34 ℃ 的鱼肌肉组织的组织学分析。B) 18 ℃、28 ℃和34 ℃组肌纤维直径统计； C) 18 ℃、28 ℃和34 ℃组肌纤维密度统计； D) qRT-PCR检测肌肉发育和生长相关基因。

为了研究温度对斑马鱼肌肉中胶原沉积的影响，对肌肉横切面进行了天狼星红染色。结果表明，肌肉中胶原蛋白（红色）的面积随着温度的升高而减少。通过westernblot进一步证明，三组中I型胶原（I型胶原，肌肉中的主要胶原类型）的表达水平趋势与天狼星红染色相似。与28 ℃和34 ℃组相比，低温组(18 ℃)I型胶原蛋白表达水平显著上调。这些结果表明温度显著影响斑马鱼的肌肉结构和胶原代谢。 低温增强斑马鱼肌肉中胶原蛋白的沉积。

图 3、温度对斑马鱼肌肉中胶原蛋白沉积的影响。A) 适应18 ℃、28 ℃和34 ℃的鱼肌肉组织的天狼星红染色。 B）Western bolt分析显示18 ℃、28 ℃和34 ℃组肌肉中胶原蛋白I的表达水平。

温度对胶原代谢相关基因转录的影响：为了探索温度影响肌肉胶原蛋白代谢的分子机制，进行了比较转录组分析以鉴定三个温度组之间的 DEG。结果表明，DEGs数量随着温度差异的增加而增加。其中，3个对照组共有28个DEG，包括两个编码I型胶原蛋白α1/2链的基因（col1a1a和col1a2）。28个DEGs的功能分类显示，这些基因被分配到11个功能项，前四项为“一般功能预测”（6个DEGs）、“功能未知”（4个DEGs）、“翻译、核糖体结构和生物发生”（ 4个 DEG）和“细胞外结构”（3个 DEG）。为了进一步研究温度对胶原基因转录的影响，进行了qRT PCR以验证转录组数据。结果表明，肌肉中大部分胶原基因（col1a1a、col1a1b、col1a2、col2a1b、col4a2、col5a1、col5a2a、col6a1、col8a1b、col12a1a）的表达水平随着温度的升高而降低，与RNA测序结果一致。与18 ℃和28 ℃组相比，34 ℃组这些胶原基因的表达显着下调。接下来，我们测试了温度是否会影响胶原代谢的假定调节基因。结果表明，大多数调节胶原蛋白合成（tgfb1a、tgfb1b、ctgfa、ctgfb）和降解（mmp2、mmp9、mmp13a、mmp14a、mmp14b、timp2a、timp2b）的基因在34 ℃组中显著下调。而与18 ℃组相比，28 ℃和34 ℃组serpinh1a和serpinh1b（原胶原特异性分子伴侣，hsp47）的表达显著上调。所有这些数据表明温度可以对与胶原代谢相关的基因的转录产生深远的影响。

图4、不同温度下斑马鱼肌肉的差异表达基因（DEG）分析。

图5 、不同温度下斑马鱼肌肉中参与胶原代谢的DEGs表达水平。

受温度调节的肌肉胶原代谢可能存在补偿机制：作为维持肌肉稳定性和完整性的关键因素，胶原蛋白合成的过度交替可能导致组织结构变化甚至疾病。为了研究温度调节的胶原代谢中是否存在补偿机制，应用了KEGG通路富集分析。通过KEGG通路富集分析，发现ER通路中的蛋白质加工在18 ℃ vs 34 ℃组中显著富集，通路中 38 个 DEG 中的 7 个（p4hb、pdia4、man1b1b、edem3、hsp70、hsp40、sec24a）被进一步选择用于 qRT-PCR 验证。结果表明，与18 ℃和28 ℃组相比，34 ℃组的p4hb、pdia4、hsp70、hsp40、sec24a显著上调。而man1b1b和edem3的表达在34 ℃组显著下调。原胶原分子中脯氨酸残基的羟基化由脯氨酰 4-羟化酶 (P4H) 催化，对胶原蛋白三螺旋结构的稳定性非常重要。有趣的是，在三个温度组之间没有观察到肌肉 Hyp 含量的差异。考虑到高温下胶原蛋白表达下调而不降低Hyp含量，鱼适应高温后原胶原中脯氨酸的羟基化水平可上调。这些数据表明，内质网中的前胶原翻译后修饰可能受到调节，以补偿不同温度下肌肉中胶原沉积的变化。

图 6. 温度对 ER 途径中蛋白质加工的影响。

讨论：温度是水产养殖中一个重要的环境因素，可以改变鱼类的生理和生化过程。许多研究都集中在温度对鱼类生理、繁殖、新陈代谢和行为的影响上。然而，人们对温度对肌肉中胶原蛋白代谢的影响知之甚少，这对维持鱼的肌肉生长和肉质非常重要。 因此，我们以斑马鱼为模型，研究了温度对鱼类生长性能、肌肉结构和胶原蛋白沉积的影响。在本研究中，虽然温度范围对斑马鱼具有耐受性，但与对照组（28 ℃）相比，高温（34 ℃）和低温（18 ℃）组斑马鱼的生长有所降低。这是合理的，因为最佳温度（28 ℃）可以促进斑马鱼的生长性能。对于近似组成，发现低温（18 ℃）组显著降低了鱼类的粗蛋白和灰分含量。虽然没有分析脂质含量，但我们可以推断出，在适应低温的鱼中，脂质占总重量的百分比增加了。肌肉纤维的特性（直径、密度、类型等）和胶原蛋白含量是鱼肉质地的重要物理指标。温度适应可以改变斑马鱼肌肉纤维的类型。本研究发现，温度适应后，肌纤维的平均直径或密度分别显著增加或减少。与 28 ℃ 组相比，34 ℃ 和 18 ℃ 组的肌肉纤维数量减少可能部分归因于生长（体型/体重）减少。 此外，肌肉胶原蛋白的含量随着温度的升高而降低。低温显著增强了斑马鱼肌肉中的胶原蛋白沉积。 这表明温度对鱼肌肉的结构和胶原蛋白沉积有深远的影响，这可能会改变鱼的肉质。需要指出的是，斑马鱼心肌胶原含量在冷适应后降低，热适应后增加的趋势与以往研究相反。提示斑马鱼骨骼肌和心肌胶原代谢的调控机制不同，这可能与斑马鱼骨骼肌和心肌的不同生理功能有关。为了破译受温度影响的胶原代谢的分子机制，进行了比较转录组分析。venn分析表明，证明在不同温度组之间的28个共享DEG中鉴定了涉及“细胞外结构”的两个胶原基因（col1a1a和col1a2）。结果表明，适应34 ℃的鱼肌肉中，大多数编码不同类型胶原α1/2链的基因表达下调。我们进一步研究了温度对胶原代谢调控基因的影响。转化生长因子β（TGF-β）及其下游结缔组织生长因子（CTGF）是组织重塑和纤维化的中心介质，促进ECM的产生和胶原的合成。大多数胶原基因tgfb1（tgfb1a，tgfb1b）和ctgf（ctgfa，ctgfb）的下调表明高温抑制了胶原的合成。基质金属蛋白酶（MMPs）及其抑制剂（TIMP2）参与胶原降解的调节。在本研究中，这些基因分别在低温组和高温组同时上调或下调。

胶原代谢的过度变化（增加或减少）可能导致组织结构的变化或生理功能障碍。 在这项研究中，证明ER途径中的蛋白质加工受温度显著影响。内质网 (ER) 是蛋白质翻译后修饰和折叠的主要细胞内场所，包括原胶原。错误折叠的蛋白质与分子伴侣一起保留在 ER 腔内。最终错误折叠的蛋白质被定向降解。 热休克蛋白 (Hsps) 是内质网驻留分子伴侣，可防止蛋白质变性，并通过诱导对各种应激的耐受性来保护细胞。与先前的报道一致，在本研究中，这些基因（hsp40、hsp70等）在高温下显著上调，表明它们在温度适应中起着重要作用。脯氨酰 4-羟化酶 (P4H) 对原胶原分子中脯氨酸残基的羟基化对于稳定胶原蛋白的三螺旋结构很重要。值得注意的是，该途径中p4hb基因的表达在34 ℃组中显着上调。 众所周知，羟脯氨酸（Hyp）是脯氨酸羟基化的产物，主要存在于胶原蛋白中，传统上用于量化总胶原蛋白。众所周知，蛋白质合成、转换和折叠基因的差异调节对于热适应和驯化很重要。在本研究中，富集蛋白加工途径中的一些DEG与胶原纤维的合成、降解、折叠和组装有关，包括p4h、sec61、hyou1、hspa5、hsp90b1、sec13/31和sec23/24。其中，p4h对胶原中脯氨酸的羟基化具有特异性，而其他基因则没有特异性，可能与许多蛋白质的合成、周转、折叠和运输有关。因此，除了胶原蛋白，较高的温度也可能影响其他蛋白质的沉积。

结论：本研究表明，温度对斑马鱼的肌肉结构和胶原代谢有深远的影响。 低温可促进斑马鱼肌肉中胶原蛋白的沉积。 此外，胶原蛋白翻译后过程中也可能存在温度补偿机制。因此，建议在水产养殖过程中，适当的低温可以促进鱼肌肉中胶原蛋白的沉积。 我们的数据不仅可以丰富鱼类胶原代谢调控机制的基础知识，还有助于制定生产高质量鱼产品的策略。

原文出自：Effects of temperature on muscle growth and collagen deposition in zebrafish (Danio rerio) - ScienceDirect