＊康雅芳∕工研院生医所医药技术组药物分析研究部副研究员
＊廖培茹∕工研院生医所医药技术组药物分析研究部副研究员
＊吕宜蓁∕工研院生医所医药技术组药物分析研究部副研究员
＊许振霖∕工研院生医所医药技术组药物分析研究部经理

The Validation of an Analytical Method Following GMP Regulation

■摘要
为提升国内制药品质、避免药品在制造过程中可能产生之交叉污染，以及在生产过程中误用不当原/物料之情形，政府在1982年开始推动GMP(Good Manufacturing Practice, GMP)药品优良制造规范。

本文主要介绍药品GMP规范下的分析方法确效之执行，内文中将以最被广泛使用的HPLC层析设备作为范例，说明如何执行分析方法的确效。

■Abstract
Avoiding the use of wrong raw materials and avoiding cross-contamination from the production of medicine can really improve the quality of medicine. Hence, the GMP (Good Manufacturing Practice) regulation was introduced and executed in Taiwan in May 1982.

The purpose of this article is to introduce the development of analytical method and validation according to GMP regulations. The high performance liquid chromatography (HPLC) instrument, the most used analytical tool in the pharmaceutical industry, will be used as a demonstration instrument.

一、前言
为确保及提升药物质量，政府已全面实施药品优良制造规范(GMP)，对于与分析药物质量有关的分析方法，也另有「分析确效作业指导手册」规范。优良成熟的制造技术及质量管理，可决定所生产的药物质量，而品管检验更需要可靠有效的量测技术；因此一个具有可靠性的分析检测方法，是整个药物制程确效及维持药物质量的基础。

分析方法的确效，其主要的目的在于确认该方法是否确实达到适用于所期望检测之目的，因此分析方法的确效可解释为：由实验室经研究后所建立之程序，且显示此方法符合欲分析应用需求时的特征。所以为确保分析数据之准确性及可靠度，应建立合适的分析方法。在进行分析方法确效前，应先完成分析设备之校正及验证，分析仪器设备的验证应包括：设计验证(Design Qualification, DQ)、安装验证(Installation Qualification, IQ)、操作验证(Operational Qualification, OQ)，以及性能验证(Performance Qualification, PQ)等。另外，在整个确效过程中所使用的标准品或对照标准品，亦应有能证明其成分、来源、纯度、质量之适当文件以供参考。

执行分析方法确效前，应针对欲执行的方法规划实验设计，写成计划书以利实验进行。计划书中应详细说明确效目的、确效项目、实验内容、执行步骤、评估标准设定，并由执行分析方法确效单位之质量负责主管审核，待通过后才能进行试验；当分析方法确效执行完毕后，也应有一份完整的试验执行结果报告，并由单位之品保负责主管审核通过后才算完成。图一为分析确效流程。

【图一 分析确效流程】

二、分析方法确效之种类及所需代表性特性(分析参数)要求
一般分析方法可分为三大类，第一为法定分析方法(Regulatory Analytical Procedure)，例如USP/NF、BP收载的分析方法就属于此类；第二为替代分析方法(Alternative Analytical Procedure)，属于非药典方法，例如厂内自行开发之分析方法；第三为具安定性指标的分析方法(Stability-Indicating Method)，适用于安定性试验之分析。以下为常用于药物分析且需要执行确效的方法：

1.鉴别试验(Identification tests)；
2.杂质(不纯物)含量之定量试验与杂质之管制限度试验(Quantitative test and limit tests for impurities)；
3.在原料药或成品之检品中，有效成分的定量试验(Assays)；
4.其它，如溶离度试验(Dissolution tests)、粒径分析(Particle size determination for drug substances)等方法。

此外，在原料药制程中的重要中间体及设备清洁确效分析等，其所使用之分析方法确效也与前文所提的试验同等重要。

对于相关分析方法的使用目的，应于进行确效前即充分了解，因为此目的与所需要评估的确效特性(分析参数)内容有关；在分析代表性特性(分析参数)方面有以下几项要求：
1.准确度(Accuracy)；
2.精密度(Precision)；
3.专一性(Specificity)；
4.检测极限(Detection Limit, DL)；
5.定量极限(Quantitation Limit, QL)；
6.线性(Linearity)；
7.范围(Range)；
8.耐变性(Robustness)；
9.苛酷试验(Force Degradation)；
10.溶液安定性(Sample Solution Stability)。

在美国药典(USP)和国际一致化联合会(ICH, International Conference Harmonization)对分析方法确效的指引中，提到常用的不同种类分析方法及其代表性特性的选择，可参考表一中的项目。

【表一 USP和ICH对于不同种类分析方法及其代表性特性的选择】

三、分析方法确效之执行—以高效能液相层析(HPLC)为例说明
1.系统适应性(System Suitability)
定义：依美国药典(USP)27 <621>对系统适用性的定义，系统适用性试验为进行GC(气体层析)与HPLC分析时不可缺少的一部分，可用来证明层析系统的分辨率和再现性足以作为分析使用。可用以下几点表示：
‧拖尾因素(Tailing factor)；
‧理论板数(Theoretical plate number)；
‧分辨率(Resolution)；
‧选择性(Selectivity)；
‧容量因素(Capacity)。

方法：取已配置目标浓度之标准品，重复注射进入分析仪器中，藉由仪器之设定或由分析者自行计算所得到之上述各参数值，再与评估标准比对，以判定是否合乎系统适用性。

结果评估：一般建议重复注射样品进入分析仪器中约5~6次，计算每次层析峰讯号值，其相对标准偏差RSD(Related Standard Deviation)≦2%。

2.专一性(Specificity)
定义：专一性是指当可能存在之成分(干扰物)存在时，能明确的评估标的(有效成分)分析物的能力；这些成分包括杂质、分解物，以及基质等。

方法：配置空白溶液与检品溶液，在相同条件下分别进行分析，并将检品溶液之结果与空白溶液做比较，被分析物之层析峰不得受到其它物质层析峰的干扰，且其分辨率至少应大于1.5。

若有不纯物且可取得时，可于成品或原料药中加入已知量的不纯物，证明这些不纯物与其它成分，或个别不纯物中可以被适当的分离。若不纯物无法取得时，则可将含有杂质或分解产物的样品，用药典的方法或另一个已经确效的分析方法比较其结果。必要时，可将样品经苛酷试验处理后，获得的不纯物再进行分析。

另外，可使用HPLC处理数据的软件(侦测器为Photodiode Array)，计算Peak purity辅助证明层析峰之纯度。

结果评估：建议列出空白溶液与检品溶液之层析图，并标示标的待测物及不纯物之波峰，被分析物之层析峰与其它物质层析峰之间的分辨率至少应大于1.5，且须附上有效成分波峰的纯度证明。

3.准确度(Accuracy)
定义：准确度是用来表现检测值，与公认真值或公认对照值之接近程度，亦可称为真实度。分析方法的准确度是以检测结果与真正值的接近程度来表示。一般可在待测样品或已知成份的赋型剂中，添加已知量的待测物标准品，测试添加标准品之百分回收率；通常以相对样品添加标准品的百分回收率来表示。

方法：
(1)原料药
‧将分析方法应用于已知纯度的标的分析物(例如：对照标准品)；
‧将探讨中的分析方法与另一个已知准确度的分析方法分别做测定，并将所得的分析结果加以比较；
‧当精密度、线性及专一性都已确立后，进而推断准确性；
‧直接配制三种不同原料药浓度，与标准品比较，并计算其百分比回收率。

(2)成品
‧将已知量的标的分析物加到制品的组成物中(通常为空白处方或赋形剂)，制成组合的混合物，再用分析方法分析此混合物；
‧如果无法取得全部制剂组成成分，可将已知量的标的分析物加至成品中再分析比较；
‧当精密度、线性及专一性都已确立后，进而推断准确性。

(3)不纯物
‧不纯物可获得时，于药品原料或成品中加入已知量的不纯物；
‧如果无法取得不纯物时，可使用药典方法或另一个已经确效的分析方法比较。

一般建议准确度浓度范围的选择为80%、100%、120%，或是在50~150%之间选择三个浓度(浓度100%是指分析方法建立时，欲分析物的目标浓度)；此三个样品浓度进入仪器分析时，每个浓度至少需重复注射3次，可得至少9个数据以供计算准确度。

结果评估：一般评估标准的订定，原料药的百分回收率要求比制剂严格，而不纯物因为含量较低，可放宽要求标准。原料药在每一个浓度的平均百分回收率应在100±1.5%，9份测试溶液的平均百分回收率应在100±1.5%、RSD≦1.5%；制剂成品在每一个浓度的平均百分回收率应在100±2.0%，9份测试溶液的平均百分回收率应在100±2.0%、RSD≦2.0%。

4.精密度(Precision)
定义：精密度是用来表现从同一均质检品多重取样，在规定条件下所得到的一系列量测值之间的接近程度；可用来评估分析方法重复试验后，所得到的数据之再现性。ICH将精密度分为：
(1)可重复性(Repeatability)：指在间隔一段时间后，同样的操作情况下所产生的再现性，又可分成(i)注射可重复性，指仪器本身的再现性，以及(ii)分析可重复性，指分析人员执行分析结果的再现性；
(2)中间精密度(Intermediate precision)：针对实验室每日实际发生的变异情况而定(同一个实验室、同一个分析方法)，在不同分析日期、不同分析人员和不同分析设备的情况下所产生的差异性；
(3)再现性(Reproducibility)：指在不同的实验室进行分析工作所得量测结果之精密度。
方法：
(1)可重复性(Repeatability)又可分成(i)注射可重复性：一般作法为配制100%目标浓度的分析标准品，将此分析物重复注射至少6次，计算这些讯号的相对标准差及可接受的评估标准，通常建议RSD≦1~2%；对于不纯物或浓度较低的分析物，RSD≦10~20%的范围是可被接受的。(ii)分析可重复性：评估在正常情况下，分析人员按照分析方法执行所得结果的再现性，可由准确度的结果评估；
(2)中间精密度(Intermediate precision)：评估分析方法受实验室内一些不可避免之变量影响的程度，如不同天、人或仪器等。规划两位分析人员，在不同天独自准备样品约3~10份，并且各用不同序号的分析管柱，在不同的高效能液相层析仪进行分析，比较两人分析结果的差异；
(3)再现性(Reproducibility)：比较在不同的实验室进行同一种分析方法其量测结果的差异性。

结果评估：一般用相对标准偏差(Related Standard Deviation, RSD)表示，其计算方式如下：

5.线性(Linearity)
定义：线性是指在标的分析物一定浓度的范围内，由该分析方法所得之试验结果与标的分析物的浓度成正比。

方法：
(1)建议至少做5个不同浓度之测试，以评估线性区间范围；
(2)有效成分分析方法(Active Component Assay Method)，浓度范围应含待测物于样品中实际含量80~120%；
(3)有效成分与不纯物一起测试时，不纯物含量以面积(%)表示，检测浓度则须从定量极限到待测物于样品中已知含量浓度的120%之间；
(4)利用稀释法配制不同浓度之标准品；
(5)利用统计法评估线性。

结果评估：5个不同浓度之标准品，每个浓度至少重复分析3次，测试所得之大小讯号对不同浓度作图，画出线性曲线，计算(i)回归 线(Regression Line)；(ii)相关系数；(iii)Y轴截距，线性的判定系数(R²)至少≧0.999，Y轴截距须尽量接近原点。线性作图如图二及表二所示。

【图二 测试所得之讯号对不同浓度作图】

【表二 X为减量线浓度，Y为讯号值】

结果如下：
(1) Intercept                                  0.004
(2) Limit of Linearity and Range   0.102~0.610 mg/mL
(3) Slope                                       3.935
(4) Correlation coefficient             0.999
(5) Relative standard deviation     ≦2~3%

6.范围(Range)
定义：范围是指在使用该方法分析检品中的标的分析物，其浓度上限与下限之间距，所得结果具有适当的准确度、精密度及线性关系。

方法：可参考线性的配制方法，连续稀释不同浓度之标准品。
结果评估：从准确度、精密度及线性的结果来决定范围。

7.检测极限(Detection Limit, DL)
定义：检测极限是指在使用该方法时，检品中的标的分析物可被检测出的最低量，但未必能定量出标的分析物之正确值。

方法：
(1)稀释一系列浓度的样品进行侦测，直到浓度被稀释到被侦测浓度之讯号(S)对噪声(N)的比值≧3的最小浓度，此即为检测极限；
(2)测量空白样品的讯号和测定含检测极限浓度范围的检量线，计算出标准偏差(SD)，再代入下列公式可算出检测极限浓度。
DL = 3.3 * δ / S
DL：检测极限浓度
δ：讯号标准偏差
S：校正曲线线性斜率

讯号标准偏差(δ)有以下两种做法：(i)量测适当数目的空白样品之讯号，再计算其标准偏差；(ii)利用标的分析物浓度在DL范围内之已知浓度做检量线，线性回归所得之直线的残余标准差，或回归线在Y轴截距的标准差，当作公式中之标准偏差值。

结果评估：前述方法所得之检测极限浓度，应配制实际样品浓度验证，将检测极限浓度重复配制3份，检视每份溶液所得层析图之讯号(S)对噪声(N)的比值须≧3。

8.定量极限(Quantitation Limit, QL)
定义：最低定量浓度是指在使用该方法时，检品中的标的分析物可被量测出的最低量，而且其结果具有适当的准确度与精密度。

方法：
(1)稀释一系列浓度的样品做侦测，直到浓度被稀释到被侦测浓度之讯号(S)对噪声(N)的比值≧10的最小浓度，此即为定量极限；
(2)测量空白样品的讯号和测定含定量极限浓度范围的检量线，计算出标准偏差(SD)，再代入下列公式可算出定量极限浓度。
QL=10 * δ / S
QL：定量极限浓度
δ：讯号标准偏差
S：校正曲线线性斜率

结果评估：重复配制最低定量浓度3份后分析，检视每份溶液所得层析图之讯号对噪声的比值。

图三为层析讯号对噪声比的量测，由比值可计算出DL与QL。

【图三 讯号(S)对噪声(N)的比值之量测】

9.耐变性(Robustness)
定义：耐变性是指该分析方法不受参数以小幅度变异所影响之能力的表现，为该方法在正常使用时之可靠性指标。

在分析方法开发之阶段中，应考虑是否要评估该分析方法之耐变性，评估之内容则与方法本身之类型有关。

方法：以HPLC为例，故意改变分析条件的幅度，其改变项目如下：
(1)管柱种类：不同批次或不同厂商；
(2)移动相溶剂比例改变；
(3)移动相pH值改变；
(4)移动相流速改变；
(5)管柱温度改变。

结果评估：先确认有效成分之百分回收率是否介于原设定之正常范围，待测物在层析图中的波峰是否具对称状，与其它波峰的分辨率是否符合评估标准；另外，滞留时间、理论板数、再现性等也须评估是否在合理范围内。

10.溶液安定性(Sample Solution Stability)
定义：评估待测物在依据分析方法制备成溶液后，待测物在此溶液中能维持合理浓度的时间。

一般在实验室的操作条件下(温度/光线)，溶液通常须具有24小时的安定性。另外，也须考虑实际进行分析的时间(如将样品放置在自动取样器上进行隔夜的分析)，调整溶液安定性试验的设计，以证明根据此分析方法所配制的溶液，具有足够的安定时间，可在正常操作速度下完成检测。

方法：依据分析方法制备样品(100%目标浓度)，进行0小时分析，接着放置一段时间后，例如24小时后再进行分析样品浓度，或视实际操作状况增加分析检测点数，再计算放置后之回收率。 结果评估：建议原料药或成品之浓度差异不得超过±2.0%，含量较低之不纯物，其浓度差异可放宽标准至±15%。

四、总结
分析方法的确效，应以分析方法欲进行的目的并参考USP、ICH或其它公证单位所建议的分析代表性特性(分析参数)，以及评估实际操作时的状况，进而设计一套符合法规要求的确效计划。

对于确效所产生的文件、实验数据、层析图谱、或任何纪录都应与保存；执行方法确效后，需整理成结果报告，确效报告应列出实验项目、实验方法、数据计算、实验设计、评估标准及结果，另外附上实验数据及结果等数据，经执行确效单位之负责人审核通过后，即完成方法确效；对于未通过之结果，应书面说明解释偏离之原因，并由权责单位审查。

■参考数据
1.WHO, ”Supplementary Guidelines on GMP: Validation, Appendix 4: Analytical Method Validation,” 2006.
2.ICH, “Validation of Analytical Procedures: Text and Methodology,” Q2(R1), 2005.
3.IQA, ”Good Quality Laboratory Practice,” PQG Monograph NO.11, 2005.
4.FDA, “Draft Guidance for Industry: Analytical Procedures and Method Validation- Chemistry, Manufacturing, and Control Documentation,” 2000.
5.EURACHEM, “A Laboratory Guide to Method Validation and Related Topics,” 1998.
6.FDA, “Guideline for Submitting Samples and Analytical Data for Methods Validation,” 1987.
7.行政院卫生署，分析确效作业指导手册，2000.