摘要：卵母细胞质量是影响ART结果的关键因素之一。 因此，如何提高卵母细胞质量成为ART领域亟待解决的问题。在这项研究中，我们评估了在超数排卵过程中给予白藜芦醇 (RSV) 对小鼠胚胎发育的影响。结果表明，当卵母细胞在体外被孤雌激活时，RSV处理组的囊胚率显著高于对照组。在自然受精卵母细胞组中，RSV治疗组的卵裂率和囊胚率显著高于对照组。对于老年小鼠，RSV治疗组的平均卵母细胞数、卵裂率和囊胚率也显著高于对照组。年轻和老年鼠经RSV处理后，卵母细胞线粒体膜电位和线粒体DNA拷贝数均显著增加。RSV治疗后，年轻和老年小鼠卵丘细胞线粒体生物发生相关基因的表达显著上调。数据表明在超数排卵期间给予RSV 可改善年轻和老年小鼠的卵母细胞质量，增加从老年小鼠中取出的卵母细胞数量，并改善卵母细胞线粒体功能。

关键词：白藜芦醇  卵母细胞质量  线粒体  小鼠

简介：卵母细胞的质量与线粒体功能密切相关。 卵母细胞在成熟过程中需要大量能量来排出第一极体和第二极体以完成减数分裂，而线粒体是该能量的主要来源。Munne等人和Gianaroli等人表明，老年妇女胚胎的非整倍体率高达60–70%。研究表明，线粒体功能障碍是老年女性卵母细胞质量下降的重要原因。因此，改善卵母细胞的线粒体功能是提高老年妇女生育能力的一项有前景的措施。白藜芦醇 (RSV) 是一种多酚化合物，在红葡萄皮、红酒和其他植物提取物中含量丰富。 早期的研究表明，RSV 通过激活长寿基因 Sir2 (SIRT1) 来延长酵母、线虫和果蝇的寿命。Baur等人证明RSV可以改善身体代谢指数，降低高热量饮食下小鼠的死亡风险，首次证实RSV对哺乳动物具有抗衰老作用。随后的研究发现RSV可以通过SIRT1激活PGC-1α，进一步上调线粒体生物发生相关基因的表达，增强线粒体的功能。此外，RSV还被认为通过SIRT1 FOXOs途径增加细胞抗氧化活性。近年来，RSV 对哺乳动物繁殖的有益作用引起了越来越多的关注。据报道，给幼鼠喂食 RSV 12 个月，可延长小鼠的生殖寿命。RSV还能促进牛卵母细胞体外成熟和胚胎发育。Mukherjee等人报道，IVM期间RSV治疗通过增加细胞内GSH和降低ROS水平刺激胚胎发育。梁等人表明 RSV 主要通过减少 ROS 的产生来延迟体内的排卵后卵母细胞衰老。 此外，RSV 可提高胰岛素敏感性，导致多囊卵巢综合征 (PCOS) 患者的胰岛素水平下降。先前的研究表明，卵母细胞的线粒体生物合成与卵泡的发育是同步的。 没有关于在超排卵期间给予白藜芦醇对卵母细胞质量影响的研究。假设在超排卵过程中添加RSV可导致卵母细胞中线粒体的生物发生并提高卵母细胞的质量。在本研究中，我们评估了在超排卵过程中添加的RSV对小鼠胚胎发育的影响。

动物研究：2-3月龄和 10-12月龄的 CD1 品系小鼠分别用作年轻和老年动物的生殖模型。光照间隔为12小时。经过1周的适应期后，通过腹膜内 (i.p.) 注射 5 IU 怀孕母马血清促性腺激素，然后在 48 小时后注射 5 IU 人绒毛膜促性腺激素 (hCG) 进行超数排卵。注射人绒毛膜促性腺激素14h后取卵。将 RSV 溶解在DMSO 中制成储备溶液 (20 g/L) 并储存在 - 20 ℃。给药前用生理盐水将原液稀释至终浓度为2.0 g/L。对照组在使用前用生理盐水将DMSO稀释至相同浓度（10%）。然后在超排时分别腹腔注射RSV (20 mg/kg)或相同体积的稀释DMSO。计数卵母细胞总数，评价胚胎发育情况。

卵母细胞采集和胚胎培养：卵母细胞和受精卵的制备方法之前已经描述过。简而言之，在 hCG 注射后 14 h，雌性小鼠被安乐死，从输卵管壶腹收集卵丘细胞 - 卵母细胞复合物（COC）到 M2培养基中。随后，将 COCs 短暂（30 s）暴露于透明质酸酶（300 mL/mL）以去除卵丘细胞。然后分别收集卵丘细胞和卵母细胞以供进一步使用。年轻小鼠组分别通过孤雌激活和体内受精获得胚胎。老年小鼠组仅通过孤雌激活获得胚胎。雌性小鼠与9-10周龄的雄性小鼠交配体内受精。雌性小鼠阴道口处存在阴栓认为交配成功。成功交配的雌性小鼠被安乐死，输卵管壶腹收集受精卵放入 KSOM 培养基中。 受精卵和胚胎均在 37 °C 和5% CO2下孵育。活化液为无钙CZB培养基，含10 mM SrCl2和5 μg/mL细胞松弛素B（CB）。去除卵丘细胞的卵母细胞先在CZB培养基中洗涤3次，然后于活化液中孵育4-6 h。活化完成后，用KSOM培养基洗涤卵母细胞3次，并将卵母细胞置于KSOM培养基中进行培养，用石蜡油覆盖。

JC-1染色评价线粒体膜电位：JC-1染色检测MMP。 卵母细胞在含有 JC-1 (15 μg/mL) 的 KSOM 培养基中在 37 °C 培养箱中孵育 10 分钟。在线粒体中，JC-1 的单体形式发出绿色荧光，而聚合形式发出红色荧光。 使用Image J软件处理图像。 通过测量红色与绿色荧光的比率来评估 MMP。

mtDNA的相对定量：用微量DNA提取试剂盒分别提取卵丘细胞和卵母细胞的DNA。如前所述，根据以下方法检测mtDNA的量。简而言之，通过使用实时定量PCR（qRT PCR）对与核基因（β2-微球蛋白，β2M）单拷贝区域相关的独特mtDNA片段进行定量，评估COC中的mtDNA含量。扩增了 127 bp 的 mtDNA 片段和 95 bp 的 β2M 基因片段。

RSV对小鼠超数排卵及胚胎发育的影响：年轻小鼠超数排卵的结果如表1所示。共有26只小鼠，每组13只，分为3个平行重复。对照组和RSV组的卵母细胞总数分别为269个和281个，MII卵母细胞数分别为125个和142个。两组平均卵母细胞率和 MII 率相似。随机选择对照组和RSV组的60个和70个MII卵母细胞进行孤雌生殖激活，其余用于进一步研究。体外培养结果显示，RSV组囊胚形成率明显高于对照组。

RSV对年轻小鼠自然受精胚胎发育的影响：总共12只小鼠，每组6只，被分成3个平行重复。 最后，对照组和 RSV 组分别有 4 只和 6 只小鼠成功交配。 RSV 和对照组的 2 细胞胚胎和未受精卵母细胞总数分别为 141 和 82。两组的平均卵母细胞数相似。RSV组的卵裂率和囊胚率显著高于对照组。

RSV对老龄小鼠超数排卵和孤雌胚胎发育的影响：我们评估了 RSV 对老年小鼠超数排卵的影响。 总共28只小鼠，每组14只，被分成5个平行重复。 对照组和RSV组的卵母细胞总数分别为152个和272个，MII卵母细胞数分别为98个和187个。与对照组相比，RSV组的平均卵母细胞数量显著增加。然而，两组的MII率无统计学差异。随机选择对照组和RSV组的67个和113个MII卵母细胞进行孤雌激活，剩余的用于进一步研究。体外培养结果显示，RSV组的卵裂率和囊胚率明显高于对照组，与年轻小鼠的结果相似。

RSV对年轻和老年小鼠卵母细胞MMP和mtDNA拷贝数的影响：为了进一步观察补充 RSV 对卵母细胞线粒体生物发生和功能的影响，定量分析了 MMP 和 mtDNA 的相对含量。结果表明，无论是年轻小鼠还是老年鼠，RSV组的MMP和mtDNA的相对量均显着高于对照组，卵丘细胞也是如此。

RSV对年轻和老年小鼠卵丘线粒体生物发生和抗氧化相关基因表达的影响：QRT-PCR结果显示RSV组SIRT1在卵丘中的表达显著高于对照组。RSV组线粒体生物合成及抗氧化相关基因PGC-1α、NRF-1、TFB-1的表达显着高于对照组。RSV 组的卵丘细胞中FOXO1 、 FOXO3和 SOD2也显著上调。

本研究表明，在超数排卵过程中补充RSV可上调线粒体生物发生相关基因的表达，增加卵母细胞和卵丘细胞中MMP和mtDNA的拷贝数，促进年轻小鼠和老年小鼠的体外胚胎发育。 此外，在老年小鼠中，RSV 组的卵母细胞数量显着增加。在超数排卵期间补充RSV显著增加卵母细胞和卵丘细胞中的mtDNA拷贝数；这与胚胎质量和妊娠率呈正相关。此外，RSV 组的 MMP 也显著增加，表明在超排卵期间添加 RSV 改善了线粒体功能。 因此，超排卵期间补充RSV可通过增强线粒体功能进而提高卵母细胞整倍体率来改善卵母细胞质量。已知线粒体基因的表达会影响卵母细胞的质量。从非生殖细胞的实验结果可知，RSV可以激活AMPK和SIRT1，两者都可以上调线粒体生物发生和抗氧化相关基因的表达，提高细胞的抗应激能力。我们的发现以及其他人的发现都表明 RSV 对卵母细胞具有相同的影响。因此，我们假设 RSV 分别通过激活 PGC-1α 和 FOXOs 通路来改善卵母细胞质量。一些研究表明，在短期RSV治疗期间，对窝产仔数没有显著影响。这可能是由于不同研究中使用的 RSV 剂量不同。与喂食方式相比，通过腹腔注射可以充分利用药物。

结论：在超排卵期间补充 RSV 可改善卵母细胞线粒体功能。 在超排卵期间补充 RSV 可以提高年轻和老年小鼠的卵母细胞质量，并增加老年小鼠的卵母细胞数量。

原文出自：Effect of resveratrol on superovulation in mice - ScienceDirect