脱靶Cre表达

当Cre不在驱动Cre表达的启动子直接支配下表达在其他组织或器官中时，就会发生脱靶Cre表达。 

如果Cre品系发生这种情况，而实验人员又无法发现，那么floxed小鼠基因可能会在意想不到的组织中被删除。 

生殖系中的脱靶Cre表达可能会特别棘手，因为您的鼠群中可能会出现所有细胞中都有完全重组的敲除等位基因的小鼠。

通常，生殖系表达Cre是因为减数分裂后卵母细胞中持续存在Cre RNA或蛋白质。

（图1：位于两个loxP位点两侧的引物（绿色）将会在删除等位基因后扩增获得较小产物）

Cre重组loxP位点的效率受loxP位点在基因组内的位置以及它们之间距离的影响。因此，相同Cre转基因切割不同loxP等位基因的效率可能不同。

如果您发现loxP基因没有被有效切割（也就是您的floxed 鼠靶标的基因表达水平没有被充分降低），这可能会非常令人沮丧，那该怎么做呢？1

如果您发现自己遇到了这种情况，应重新对小鼠进行基因分型（使用新DNA样本），确认您的小鼠是loxP等位基因纯合子并携带Cre转基因。 2

接下来，检查您测试删除效率/基因表达所用的方法，确保其适用于您的特异性loxP等位基因。

比如，如果条件性等位基因使loxP位点位于目标基因外显子5的位置，则在重组后，外显子5会被删除，但外显子1-4和启动子会保持完整，并且仍可产生重组基因座的转录产物。

如果监测mRNA表达的引物落在外显子5的上游区域，您可能看不到表达水平显著下降。 3

如果您确认Cre未有效切割您的loxP基因，应尝试将目标基因的完整敲除等位基因引入鼠群，获得携带目标基因复合杂合子（一个loxP侧翼等位基因和一个敲除等位基因）及Cre转基因的小鼠。

在这些小鼠中，Cre只需重组一个loxP等位基因即可，而不是两个，这样可以提高其重组效率。

如果您的Cre品系是他莫昔芬诱导的Cre品系，则按照上述步骤1和2操作。

接下来，将他莫昔芬诱导的Cre品系与Cre报告基因品系进行杂交。  在Cre阳性、报告基因阳性小鼠中测试您的他莫昔芬给药方案，确认他莫昔芬能否到达目标组织/器官并有效诱导重组。

事实上，最好在实验开始时就这样做，以便提前制定他莫昔芬诱导方案。

如果清楚了解所有这些步骤，则如上所述（步骤3）引入完整敲除等位基因或许可以提高他莫昔芬依赖性重组效率。

Cre可能会自行产生表型，这会使数据解释变得更加困难。

造成这种情况的原因可能是Cre转基因插入位点对附近内源基因有影响。

另外，由于小鼠基因组中的隐性半同源loxP位点之间重组会造成“Cre 毒性”，因此，Cre高表达的小鼠可能会出现突变表型或死亡。  

为了确保您观察到的所有表型是由于目标基因被删除而不是Cre转基因引起的，您需要在实验中纳入携带相应loxP等位基因的野生型Cre阳性小鼠作为对照小鼠。

在创建下一个条件性敲除模型之前，您应该熟悉要使用的品系中Cre的表达模式。