摘要：抗癌药物毒性大，对环境有很大的危害。本研究的目的是采用一种创新的方法评估trabectedin对斑马鱼肝细胞系（ZFL）和胚胎幼虫的毒性。在 ZFL 细胞中，使用 MTT 和台盼蓝排除测定法测量trabectedin的细胞毒性，并通过荧光激活细胞分选 (FACS) 和免疫荧光分析评估细胞形态。就死亡率/细胞活力而言，Trabectedin对ZFL细胞的毒性是斑马鱼胚胎幼虫的60倍，在42.7µg/L时观察到胚胎幼虫死亡， 0.04µg/L时观察到培养细胞无活力。免疫荧光染色显示在0.04至0.15µg/L范围内暴露于trabectedin的ZFL细胞的形态学改变呈剂量依赖性. 此外，trabectedin在浓度低于50.3µg/L时会导致斑马鱼胚胎幼虫的形态异常，例如尾部畸形、心包水肿和缺乏平衡。关于幼虫行为分析，在黑暗条件下暴露于42.7µg/L的 trabectedin增加了斑马鱼的速度和总距离。这些结果表明，trabectedin对体外和体内斑马鱼模型中都是有毒的，因此，这种抗癌剂在环境中的出现和持续存在可能是生物群的一个潜在风险因素。

关键词：抗癌剂  斑马鱼的运动行为  ZFL细胞  发育毒性  细胞毒性

简介：全世界有数以千万计的患者接受化疗，预测表明癌症病例数量将大幅增加，从而导致抗癌药物（AAs）的使用增加。在给患者服用AAs后，由于废水处理厂对生活和医院残留水的处理效果有限，AAs及其各自的代谢物会释放到环境中。多项研究表明，AAs 存在于水生环境系统中，例如顺铂、依托泊苷、多柔比星、环磷酰胺和他莫昔芬，浓度范围为 0.22 至 86.2 ng/L，而在地下水中，AAs 的含量为 2.1 至 29.7 ng/L。由于其作用机制通常包括与DNA的相互作用，AAs具有遗传毒性、致癌性、致突变性和/或致畸性，长期接触的情况下可能会对水生生物产生不良影响。已检测到饮用水中存在 AA，置环境和人类健康于危险之中。然而，水生环境中 AA 的存在及其对水生生物群和人类健康的影响尚未得到充分研究。trabectedin用于治疗软组织肉瘤，于 2007 年进入欧洲市场，八年后进入美国市场。分子通过结合DNA富含鸟嘌呤的特定序列，进而影响修复机制、转录调节和肿瘤微环境，从而维持其抗癌作用。与在高浓度 下具有细胞毒性的典型 DNA 嵌插剂（例如替莫唑胺和铂化合物）不同，trabectedin在较低浓度下具有活性。正在进行的研究和临床试验进一步表明，trabectedin对骨肉瘤和结直肠肿瘤等其他类型的肿瘤有很好的治疗前景。考虑到trabectedin在治疗方案中的使用越来越多，单独使用或与靶向治疗中的其他AAs结合使用，其在环境中已经存在的可能性很高。因此，了解trabectedin在水生系统中的作用，了解其在环境中的持久性（半衰期）以及在水、污水污泥和废水中的检测值至关重要。大多数现有研究涉及trabectedin对哺乳动物和非人类测试模型的影响，重点关注对人类健康的直接影响，旨在更好地了解这种药物的抗肿瘤潜力。因此，关于trabectedin的环境危害的信息存在重大空白。文献中有关于AA对各种水生生物分类群的生态毒理学信息。5-氟尿嘧啶在低于 0.1 mg/L的水平下诱导生长抑制. 接触顺铂21天会影响甲壳动物大型水蚤的繁殖量，EC50值为16µg/L。暴露于68µg/L环磷酰胺7天后会导致胚胎畸形。Gajski等人使用斑马鱼肝（ZFL）细胞系、人类肝癌（HepG2）细胞和人类外周血淋巴细胞（HPBLs）来评估5-氟脲嘧啶、顺铂和足叶乙甙的毒性，并表明非靶向ZFL细胞比癌细胞更敏感。AA 对非靶标生物和细胞的危害性增加，因此有必要探索trabectedin的生态毒理学潜力潜力。本研究旨在深入了解trabectedin的环境毒性，从而更好地了解trabectedin在环境中的处置和分散是否会影响淡水鱼类。此外，本研究旨在建立体外细胞模型预测整体动物效应的可行性。

trabectedin对 ZFL 细胞活力和形态的影响：trabectedin在 24、48 和 72 小时后对 ZFL 细胞具有强烈的细胞毒性，IC50 值见表1。用作参比化合物的多柔比星在孵育 24、48 和 72 小时后的 IC50 值分别是观察到的trabectedin的 50、40 和 12 倍。

表1、MTT法分析trabectedin和多柔比星（阳性对照）对ZFL细胞的细胞毒性。TB 分析显示，与溶剂对照 (DMSO) 相比，所有测试浓度（0.04、0.08 和 0.15 µg.L-1）的trabectedin导致 ZFL 细胞活力显著降低。由于本研究中阴性对照组和溶剂对照组之间未观察到显著的统计学差异，因此选择溶剂对照组来比较我们的数据。进行 FACS 分析以检查分别由 FCS 和 SSC 轴定义的单元大小和内部复杂性。随着trabectedin浓度的增加，ZFL 细胞的直径和粒度均有所降低。

图 1. TB 排除法和流式细胞仪测定的 0.04、0.08 和 0.15 µg.L-1 trabectedin对 ZFL 细胞活力的影响。

为了进一步观察ZFL细胞的形态，对微管、F-肌动蛋白和细胞核进行了免疫荧光染色。其中一个最显著的影响是肌动蛋白丝的分布。对照细胞的外围有密集的标记，但暴露于trabectedin的细胞中呈弥漫性取向。这种改变在用最高浓度药物处理的细胞中得到了高度证实。

图2、暴露24小时后，对照组和trabectedin处理的ZFL细胞的免疫荧光染色。

对胚胎幼虫存活和发育的影响：trabectedin对斑马鱼胚胎幼虫的急性影响如表2和图3所示。在暴露 trabectedin24 小时后导致死亡，LC50 为 95.5 µg.L-1。 在随后的接触天数中，死亡率增加，在 96 小时时 LC50 值为 77.55 µg/L。暴露于trabectedin还对胚胎幼虫造成亚致死效应，例如发育异常，包括体节改变、心包水肿、尾部畸形和缺乏平衡。在24 hpf时，唯一可观察到的效应是体节改变，EC50为75.42µg/L。暴露发现心包水肿，在24、48和96 hpf时EC50分别为66.28、74.66和75.42µg/L。数值的增加并不意味着斑马鱼已经康复，而是意味着水肿鱼在随后的几天内死亡，从而导致测量的亚致死效应明显降低。还观察到尾部畸形，在72 hpf时畸形增强，EC50为42.66µg/L。在 96 hpf 时发现幼虫缺乏平衡。

图3、暴露于trabectedin的96 hpf斑马鱼幼虫的致畸显微照片

关于 96 小时的死亡率和畸形，LOEC 值（以观察到影响的最低浓度表示）为 42.66 µg/L，而 NOEC 值（以未观察到影响的最高浓度表示）为22.47 µg/L。

Trabectedin对行为的影响: 在第一个黑暗时期观察到暴露于最高浓度trabectedin的幼虫的游泳速度和总距离显著增加。在其他浓度和阶段，未观察到进一步的行为差异。对应于斑马鱼运动行为的LOEC值为42.66µg/L，而NOEC达到22.47µg/L。

图 4. 斑马鱼幼虫 (120 hpf) 在光照（白色区域）和黑暗（灰色区域）期间暴露于trabectedin后的总游泳距离 (A) 和平均速度 (B)。

结果：本研究揭示了抗癌剂trabectedin在相关的体外和体内生态毒理学，对斑马鱼的影响，从 ZFL 细胞系的细胞骨架成分到胚胎幼虫的发育和斑马鱼幼虫的运动。本研究揭示了抗癌剂trabectedin从ZFL细胞系的细胞骨架成分改变、胚胎幼虫的发育和幼虫的运动对斑马鱼的影响。Trabectedin 是一种剧毒药物，对斑马鱼细胞（非靶细胞和正常细胞）的影响与肿瘤细胞相同。考虑到trabectedin的广泛使用，这些研究结果支持了类似这项研究的必要性，以推断trabectedin的潜在环境危害。斑马鱼细胞和胚胎的敏感性差异突出了斑马鱼细胞在减少不确定性和促进淡水系统保护方面的潜在用途。在相关生态环境中斑马鱼幼虫胚胎细胞系系统是评估抗癌化合物毒性的合适工具。

原文出自：Effects of trabectedin in the zebrafish Danio rerio: from cells to larvae - ScienceDirect