斑马鱼CRISPR基因编辑技术服务，含基因敲入品系制备、基因敲入品系制备、转基因品系制备三方面。

斑马鱼基因敲入品系制备

服务简介：

1. 基因敲入(Knock in)

非同源依赖的DNA修复技术，在斑马鱼基因组定点插入外源DNA片段（荧光蛋白、PA等）。

2. 基因敲入技术特点

    2.1 定点插入；

    2.2敲入效率较低。

服务流程：

根据客户基因敲入要求进行基因分析；

cas9 mRNA和多个gRNA靶点的设计及合成；

高效gRNA靶点的筛选及效率验证；

敲入载体设计及构建；

斑马鱼胚胎的显微注射和敲入验证；

F0代斑马鱼的可遗传性筛选；

杂合子F1代斑马鱼的基因型鉴定。

环特生物优势：

国际一流的斑马鱼敲入技术以及上百例的成功经验；

特有的高效筛选方法。

案例展示：

斑马鱼基因敲除品系制备

服务简介

1.基因敲除(Gene Knockout)

根据给定GeneID或Gene name，分析基因保守结构域，在保守结构域或客户指定区域设计靶点并制备靶点gRNA，gRNA和Cas9共注射使基因产生移码突变，通过PCR筛选得到稳定遗传品系。

2. 基因敲除技术特点

    2.1 通过将基因敲除斑马鱼品系与野生型相比较，研究者可以揭示特定基因的功能。

    2.2 在基因组水平上将目标基因敲除，遗传背景干净清晰，是研究基因功能的金标准。

服务流程

▲根据客户提供的GeneID或Gene name进行基因分析——▲cas9 mRNA和多个gRNA靶点的设计及合成——▲高效gRNA靶点的筛选及效率验证——▲F0代斑马鱼的可遗传性筛选——▲杂合子F1代斑马鱼的基因型鉴定

环特生物优势

成熟的基因敲除技术快速获得稳定品系；

多靶点共注射F0代验证基因功能。

斑马鱼敲除品系成功案例

1、基因分析

分析目的基因的保守结构域；

2、靶点筛选

设计4个gRNA靶点，PCR检测包含靶点的区域真实序列，显微注射验证靶点效率；

3、大规模注射养殖F0

Cas9 pro+gRNA 共注射，共养殖 F0 约 80 条用于后期Founder筛选；

4、Founder 筛选 

F0代斑马鱼与野生型外交，收集48hpf的F1胚胎抽取基因组，PCR鉴定，测序结果在靶点位置出现双峰的认为产生突变，然后TA clone验证其可能产生的突变方式；

5、F1 代筛选

F1代斑马鱼剪尾筛选，TA clone验证突变方式：

 通过对测序图谱的分析获得突变方式为：-5bp，产生移码突变的敲除斑马鱼； 

通过对测序图谱的分析获得突变方式为：-4-3bp，产生移码突变的敲除斑马鱼模型。

斑马鱼转基因品系制备

服务简介

1. 转基因

斑马鱼转基因技术包括显微注射、电穿孔技术（电脉冲介导）、精子载体法、GAL4/UAS 转录激活系统、Tol2转座子介导、拟型反转录病毒介导、重组杆状病毒介导等方法。

2. 转基因技术目的

    2.1 通过定点敲除技术进行基因鉴定和功能研究； 

    2.2 利用报告基因对受体等蛋白质进行功能研究；

    2.3 构建各种斑马鱼突变体，通过斑马鱼疾病模型进行人类疾病研究和药物筛选；

    2.4 构建含有特异性启动子的生物感应器，用于环境监测。

3. Tol2转座子介导的转基因技术优点

    3.1 Tol2转座子可携带大片段DNA；

    3.2 Tol2转座子没有位置偏好性，几乎能整合到染色体的任意位置；

    3.3 Tol2转座子的耐受范围很广；

    3.4 Tol2作为天然的具有自主转座活性的脊椎动物转座子，能够在胚胎发育的不同时期进行有效的转移；

    3.5 Tol2转座子介导的转基因技术能够有效克服外源基因在后代传递频率低的技术难题。

服务流程

▲客户提出转基因品系制备需求→▲分析可行性→▲构建载体→▲斑马鱼胚胎注射→▲founder筛选→▲F1代斑马鱼养殖→▲F2代斑马鱼养殖

环特生物优势

1.特有的养殖方法可缩短服务周期；

2.丰富的经验和及时沟通助力科研实验。

参考文献：

[1] 刘丽丽, 王健, 王海胜,等. 斑马鱼转基因平台的建立[J]. 生物技术通报, 2013(010):120-126.

[2] 陶然, 常玉梅, 李世国,等. Tol2转座子的特性及其在转基因鱼类中的应用[J]. 水产学杂志, 2014, 000(001):60-64.

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