斑马鱼试验：鼻内注入SARS-CoV-2刺突蛋白足以引起嗅觉损伤、炎症和嗅觉功能障碍
摘要：嗅觉丧失（嗅觉丧失）是 SARS-CoV-2 感染的普遍症状。 嗅觉丧失可能由非神经元细胞感染和鼻上皮损伤驱动的几种机制来解释，而不是嗅觉感觉神经元 (OSN) 的直接感染。我们发现病毒蛋白足以引起硬骨鱼嗅觉器官（OO）的神经免疫反应。我们假设SARS-CoV-2刺突蛋白足以引起嗅觉损伤和嗅觉功能障碍。成年斑马鱼模型显示鼻内注入的 SARS-CoV-2 S RBD 主要与嗅觉器官的非感觉上皮细胞结合，并导致严重的嗅觉组织病理学，其特征是纤毛丧失、出血和水肿。然而，在 SARS-CoV-2 S RBD 注入的鱼中没有发现对食物的行为偏好丧失。成年斑马鱼嗅觉器官的单细胞RNA序列表明，支持细胞、内皮细胞和髓系细胞簇中嗅觉受体表达和炎症反应普遍缺失，同时Treg数量减少。我们的结果表明，鼻内SARS-CoV-2 S RBD足以对斑马鱼嗅觉系统造成结构和功能损伤。这些发现可能对鼻内接种SARS-CoV-2疫苗具有指导意义。
关键词：SARS-COV-2 刺突蛋白 斑马鱼 动物模型 嗅觉损伤 EOG 嗅觉受体表达
简介：气味严重影响动物的行为和生存。SARS-CoV-2 感染的一个标志是急性嗅觉丧失或嗅觉丧失。虽然大多数报告嗅觉丧失的 COVID-19 患者在发病后 2 周开始嗅觉恢复，但一小部分（~5%）报告称一个月后持续存在嗅觉障碍。病毒引起的嗅觉丧失并非 SARS-CoV-2 感染所独有的； 其他呼吸道病毒，如鼻病毒、流感、副流感和季节性冠状病毒，会导致人类嗅觉障碍。虽然 COVID-19 患者嗅觉丧失的确切机制尚不清楚，但已经提出了一系列潜在的可能原因。 首先，病毒引起的嗅觉丧失可能是由于鼻腔的炎症性阻塞，COVID-19 患者的嗅上皮 (OE) 中的促炎细胞因子水平升高。在小鼠OE中，I型干扰素的诱导导致嗅觉受体（OR）表达的广泛丧失，这表明即使在没有活跃病毒复制的情况下，炎症也可能导致嗅觉功能障碍。然而，大量 COVID-19 患者报告嗅觉障碍与鼻腔肿胀无关，因此需要进一步研究。其次，支持细胞的 SARS-CoV-2 感染可能会继发性损害嗅觉感觉神经元 (OSN)，从而损害化学气味信息向嗅球 (OB) 的传导。在小鼠和人类中，在OB的支持细胞（SCs）、嗅觉干细胞和血管周围细胞（周细胞）中检测到ace2表达，但在OSN中未检测到。此外，在人体活检中，在嗅觉器官 (OO) 的固有层和 SCs 中检测到病毒 RNA，表明 OSNs 不经常被感染。此外，用 SARS-CoV-2 感染金黄地鼠会导致大部分 SC 感染，但不会感染 OSN，然而OSN受损，纤毛的大量缺失证明了这一点。综上所述，SARS-CoV-2感染SCs可能会改变整个OO的局部代谢和炎症状态，从而导致OSN受损和随后的嗅觉缺失。SARS-CoV-2 Spike (S) 蛋白是同源三聚体，每个单体由一个 S1 亚基和一个 S2 亚基组成。S1 亚基包括一个 N 端结构域和受体结合结构域 (RBD)。 SARS-CoV-2 S RBD 与宿主细胞上的血管紧张素转换酶 2 (ACE2) 结合，然后丝氨酸蛋白酶（如 TMPRSS2）切割刺突蛋白 S1/S2 位点，以促进病毒粒子与宿主细胞膜的融合。一旦 RBD 与 ACE2 结合，就会发生复合物的内吞作用。 一旦进入细胞内，S 蛋白可能会被降解，并且可能会从受感染的细胞中释放出游离的 S 蛋白片段。事实上，据推测，受感染的细胞和病毒粒子会脱落游离的可溶性 S1 亚基，这些亚基可以结合 ACE2 并导致下游有害作用和炎症。虽然这一假设需要进一步的实验支持，但病毒衍生的蛋白质，如来自冠状病毒和 HIV 的糖蛋白，已被证明可在外周血细胞中诱导 IFN 反应。此外，已经记录了对病毒蛋白的神经炎症反应，即使在没有主动感染的情况下。例如，我们已经证明传染性造血坏死病毒的糖蛋白（G蛋白）足以触发硬骨鱼的鼻神经免疫反应。基于这项研究，我们假设SARS-CoV-2 S RBD蛋白足以引起嗅觉病理学和功能障碍。斑马鱼的嗅觉系统在分子和解剖学上与人类有很大程度的相似性斑马鱼OO由暴露在外部环境中的两个独立鼻孔组成，OSN直接检测环境水中的化学刺激。鼻孔由许多嗅觉板、指状结构组成，每一个都覆盖着非感觉和感觉神经上皮。感觉区由基底细胞、中间神经元前体、成熟的OSN和支持细胞组成，类似于哺乳动物的OE。OSN轴突成束穿过基底层，在固有层形成嗅丝。在固有层中，除了OSN轴突束外，还发现成纤维细胞、胶质细胞和血管。斑马鱼 OO 已在不同的毒物和损伤模型中进行了广泛研究。斑马鱼 OO 和 OB 的再生能力表明嗅觉恢复的动力学大约需要 2 周； 与在患有嗅觉障碍的 COVID-19 患者中观察到的相似的恢复时间表。与其他动物模型相比，斑马鱼具有繁殖能力强、发育迅速、维护成本低、身体小而透明等优点。在遗传学上，超过80%的疾病相关基因具有斑马鱼直系同源基因，并且在斑马鱼基因组中已鉴定出所有主要哺乳动物细胞因子组成员。
一些研究已经提出斑马鱼作为SARS-CoV-2的模型。尝试通过浸泡感染野生型斑马鱼仔鱼表明 SARS-CoV-2 缺乏感染或复制。将SARS-CoV-2病毒微量注射到野生型斑马鱼幼体中，发现在膀胱中有适度复制，通过其他途径微量注射时没有复制。利用野生型斑马鱼（仔鱼或成鱼）来了解SARS-CoV-2感染是有限的。成年硬骨鱼OO此前已被证明对来自病原体的蛋白质有反应。在本研究中，我们研究了SARS-CoV-2 S RBD 蛋白在 BSL-1 环境中对斑马鱼嗅觉系统的影响。本研究首次报告鼻内 (I.N.) 注入 SARS-CoV-2 S RBD 足以引起成年斑马鱼的嗅觉病变。损伤是短暂的，因为组织在 2 周内得到修复。 电生理学进一步表明成年斑马鱼在 I.N. 后对气味的功能反应受损，尽管它们没有失去对食物气味的行为偏好。
脊椎动物ACE2分子的比较分析：ACE2 蛋白是人类细胞上 SARS-CoV-2 S RBD 的受体，并在哺乳动物 OE 的支持细胞中表达。脊椎动物血管紧张素转换酶2（ACE2）分子的比较分析表明，斑马鱼ACE2和人类ACE2之间的相似性分别为72%-73%和57.5%-58%。对SARS-CoV-2 S蛋白结合区域的ACE2氨基酸进行检测发现斑马鱼ACE2在结合界面处的氨基酸具有适度的保守性。综合起来，这些数据与之前的报道一致，表明硬骨鱼 ACE2 蛋白不太可能与 SARS-CoV-2 S 结合。
SARS-CoV-2 S RBD 的鼻内注入导致成年斑马鱼的嗅觉损伤：嗅觉丧失是人类感染 SARS-CoV-2 的最早表现之一。我们之前已经证明，IHNV糖蛋白足以诱导硬骨鱼的快速鼻免疫反应和神经元激活。因此，我们假设重组SARS-CoV-2 S RBD蛋白可能足以损伤斑马鱼的OO。为了验证这一假设，我们将重组SARS-CoV-2 S RDB注入成年AB斑马鱼的鼻腔，并在3小时（h）、1天（d）、3天（d）、5天（d）和2周（w）后采样OO。阴性对照包括仅接受赋形剂 (PBS) 注入鼻腔的动物以及接受相同剂量 r-CK12a 的鱼。 我们还包括一个 Poly(I:C) 注入组作为 dsRNA 诱导的抗病毒作用的额外对照。在检查的所有早期时间点，SARS-CoV-2 S RBD 足以对斑马鱼 OO 造成严重损害。在注入后3小时，早期组织损伤的特征就是固有层出现水肿和内皮炎症。注入后1天观察到嗅板尖端和底部出现出血。在 3 h 时在上皮中观察到水肿，以组织中的空腔为特征，但到 1 d、3 d 和 5 d 时，在整个固有层发现水肿。此外，通过测量距中缝 50 μm 处固有层的宽度来量化水肿，并发现在 I.N注入 SARS-CoV-2 S RBD后 3 小时和 3 天固有层显著扩张。注入后1天、3天和5天，观察到硬骨鱼嗅觉上皮的上皮镶嵌结构缺失。注入后5天在SARS-CoV-2 S RBD注入的动物中观察到由于严重坏死导致的整个嗅板层丢失，而对照动物没有嗅板层丢失。在所有早期时间点，所有接受SARS-CoV-2 S RBD注入的动物都观察到嗅板纤毛显著缺失。接受 r-CK12a 或 Poly(I:C) 的斑马鱼没有观察到嗅觉损伤。评估 I.N. 后 OO 的恢复情况。 我们在注入后2周检查了组织切片。对斑马鱼嗅觉系统可塑性的研究表明，在 OO 化学消融 2 周后，结构和功能得以恢复。在I.N.SARS-CoV-2 S RBD后2周的OO与经赋形剂注入的OO相似。神经上皮镶嵌修复；没有水肿，纤毛看起来很健康。这些结果表明，SARS-CoV-2 S RBD足以在斑马鱼OO中造成严重但短暂的组织损伤，在缺乏活跃的SARS-CoV-2复制的情况下，可能发生嗅觉损伤。
图1、鼻内注入SARS-CoV-2 S RDB蛋白会对成年斑马鱼造成严重的组织学损伤，并在2周后恢复。
为了定位重组SARS-CoV-2 S RBD蛋白与OO之间的相互作用，在SARS-CoV-2 S RBD重组蛋白注入15分钟后，我们对在成熟纤毛OSN中内源性表达红色荧光蛋白（RFP）的OMP:lynRFP动物进行了抗His抗体免疫荧光染色。SARS-CoV-2 S RBD蛋白广泛分布于非感觉上皮，抗-His阳性区域缺乏RFP信号就证明了这一点。此外，野生型斑马鱼在接受SARS-CoV-2 S RBD注入15分钟后的非感觉区域放大图显示，沿着板层的非感觉上皮区域存在有限的点状抗His染色。SARS-CoV-2 S RBD注入15分钟的动物的同型对照染色和赋形剂注入动物上的抗-His染色在这些区域均未显示信号。为了评估斑马鱼同系物ace2是否在斑马鱼的嗅觉系统中表达，通过qPCR测量对照成年斑马鱼的OO和OB上的转录水平。我们证实了斑马鱼OO中ace2的中度表达水平，而OB中ace2的表达水平非常低。因此，SARS-CoV-2 S RBD可能与斑马鱼OO中的Ace2相互作用，尽管不能排除配体-受体相互作用的其他机制。
鼻内注入SARS-CoV-2 S RBD改变成年斑马鱼的固有层：根据H&E分析，注入SARS-CoV-2 S RBD后斑马鱼OO 3D固有层中明显存在大的纤维斑块。肺组织纤维化是 SARS-CoV-2 和 SARS-CoV 患者的标志，其特征是成纤维细胞持续存在以及胶原蛋白和其他细胞外基质成分的过度沉积。为了确定在斑马鱼固有层中观察到的变化是否与肺纤维化中发现的变化相似，我们进行了Masson三色染色，将胶原蓝染。与对照组相比，SARS-CoV-2 S RBD动物在3小时或3天内蓝色染色的胶原蛋白沉积没有增加。然而，在 3 d 时观察到大量鲜红色的沉积物，表明存在于注入动物固有层中的纤维材料由角蛋白组成，可能有助于组织愈合。细胞角蛋白 8 (CTK8) 是斑马鱼再生过程中的表皮标志物。对照成年斑马鱼 OO 中的 CTK8 染色显示非感觉上皮以及 SCs 和基底细胞中的阳性染色模式。I.N. Poly(I:C)注入没有改变 OO 中的 CTK8 染色模式。在I.N.SARS-CoV-2 S RBD后3小时，非感觉上皮镶嵌结构被破坏；祖细胞水平基底细胞通常由扁平形态变圆，柱状SCs不太明显。SARS-CoV-2 S RBD后3天，非感觉上皮高度紊乱，固有层的一些细胞中出现CTK8染色，与对照组或固有层CTK8阴性的3小时OO样本形成鲜明对比。
图 2. SARS-CoV-2 S RDB 蛋白的鼻内注入导致成年斑马鱼 OO 发生严重的细胞变化。
我们很好奇CTK8免疫反应模式的这种变化是否是由于固有层和OE受损后OO的细胞动力学改变所致。因此，我们使用抗PCNA抗体来评估处于细胞分裂合成阶段的细胞。用同型对照而非抗PCNA抗体染色的OO冰冻切片显示没有抗体反应。与赋形剂注入的OO相比，在I.N.SARS-CoV-2 S RBD后3小时和3天，PCNA反应阳性的细胞数量显著增加。与以往对斑马鱼OO的研究类似，大多数PCNA阳性细胞位于非感觉上皮中，尽管有些细胞位于板层的感觉区。注射SARS-CoV-2 S RBD后3天的PCNA阳性细胞数量与注射病毒模拟物poly（I:C）后3天的PCNA阳性细胞数量不同，这与两个注入组之间观察到的组织学差异相呼应。此外，由于 OSN 纤毛的丢失，我们很好奇神经上皮内的细胞是否凋亡。用同种型对照而不是抗激活的 caspase-3 抗体染色的 OO 冷冻切片显示没有抗体反应性。我们发现 I.N 后3 小时和 3 天凋亡细胞显著增加。 SARS-CoV-2 S RBD 在 3 h 和 3 d 时主要位于非感觉上皮细胞中，在 3 d 时一些细胞簇出现在感觉上皮细胞中。在本研究中，与之前在鳟鱼中的发现相比，单次注入病毒模拟物poly（I:C）不会导致显著的细胞凋亡，但三次注入poly（I:C）确实会导致细胞凋亡。
鼻内注入SARS-CoV-2 S RBD会导致嗅觉缺失但不会改变成年斑马鱼的食物偏好：与预注入对食物气味的反应相比，成年斑马鱼I.N.给予 SARS-CoV-2 S RBD对食物提取物的嗅觉反应瞬间显着降低，嗅觉电图记录 (EOG) 的振幅降低了 50%。暴露于SARS-CoV-2 S RBD后1分钟内，嗅觉反应降低，表明嗅觉功能发生了瞬间变化。每5分钟记录一次对食物气味的嗅觉反应4秒，持续1小时。在 5 分钟的间隔期，用水冲洗 OO 以清除多余的气味并避免过度暴露导致 OSN 脱敏。经 SARS-CoV-2 S RBD 注入的鱼对食物提取物的嗅觉反应降低持续 1 小时。对照组动物对食物气味的反应在任何时间点都没有减少。这证实了SARS-CoV-2 S RBD注入个体对食物提取物的嗅觉反应降低并非由于过度暴露于食物气味导致OSN脱敏，而是与OO受损有关。为了进一步量化 I.N. SARS-CoV-2 S RBD引起的嗅觉降低程度，我们利用了斑马鱼中存在的两个独立的嗅觉室，将同一动物的一个鼻孔暴露于 SARS-CoV-2 S RBD 蛋白，将同一动物的另一个鼻孔暴露于赋形剂 (PBS) 并等待 3 小时、1 天、3 天或 2 周，然后通过 EOG 测量嗅觉。我们观察到3小时SARS-CoV-2 S RBD鼻孔对食物和胆汁的嗅觉反应分别比赋形剂注入的鼻孔减少49%和44%，在注入后1天，食物和胆汁嗅觉反应的嗅觉功能分别减少60%和89%。接受SARS-CoV-2 S RBD注入的鼻孔中，一些个体在1天后对胆汁没有EOG反应。对食物提取物的嗅觉敏感性降低小于胆汁，这可能是由于与食物中发现的氨基酸相比，参与胆汁酸检测的 OSN 数量较少。SARS-CoV-2 S RBD注入2周后，鼻孔之间的EOG反应没有差异。与赋形剂注入的鼻孔相比，注入对照重组蛋白（r-CK12a）后3h、1d、3d和2w对食物和胆汁的EOG反应没有显著差异。我们的结果表明，EOG 观察到的 SARS-CoV-2 S RBD 诱导的嗅觉丧失并非特定于 OSN 的一个子集，因为SARS-CoV-2 S RBD 注入的斑马鱼中食物提取物和胆汁嗅觉信号均受到抑制。
图 3. SARS-CoV-2 S RDB 蛋白的鼻内注入导致成年斑马鱼嗅觉丧失。
斑马鱼嗅觉器官的单细胞分析：为了更好地了解SARS-CoV-2 S RBD诱导成年斑马鱼嗅觉功能障碍的机制，我们进行了单细胞RNA-Seq（scRNA-Seq）研究。鉴于我们的组织学发现和 SARS-CoV-2 S RBD 与非感觉上皮区域的结合，我们假设转录扰动由于间接机制而发生在支持细胞和 OSN 中。在注入SARS-CoV-2 S RBD 3小时或3天后进行scRNA-Seq。我们共鉴定出8个神经细胞簇（NC）、5个SC簇、3个内皮细胞簇（EC）和7个白细胞簇（淋巴和髓细胞）。
鼻内注入SARS-CoV-2 S RBD可诱导成年斑马鱼嗅觉器官的炎症反应和广泛的嗅觉受体表达丧失：鉴于从组织学和细胞动力学观察到的形态变化以及 EOG 对气味的反应改变，我们假设 SARS-CoV-2 S RBD 治疗导致 OSN 的转录组变化。斑马鱼 OO 的细胞景观受到 SARS-CoV-2 S RBD 注入和时间的影响。与对照组和3小时治疗组相比，在治疗后3天，表达omp的成熟纤毛OSN的比例显著降低，这在神经元细胞类型的比例中尤为明显。相比之下，表达细胞周期标志物（aubk、ecrg4和mki67）和神经元分化和可塑性标志物（neurod1、neurod4、gap43、sox11和sox4）的神经元祖细胞在治疗后3天扩增。有趣的是，与对照组相比，在从 COVID-19 和甲型流感患者死后人体实质收集的更多单核转录组中发现了许多这些可塑性相关的基因。此外，检测到属于淋巴细胞2簇的细胞比例显著下降，该簇在注入重组SARS-CoV-2 S RBD后3小时表达Treg细胞标记物（foxp3b）。在第 3 天，我们观察到第三个淋巴细胞簇，但在 3 小时未检测到该细胞簇。该分子在哺乳动物的Th1型免疫反应中具有免疫调节作用。这些结果表明，斑马鱼OO的神经元和免疫细胞亚群对SARS-CoV-2 S RBD有重要的细胞反应。
总之，我们的研究表明，SARS-CoV-2 S1蛋白的一个片段RBD可导致成年斑马鱼的嗅觉病理学和嗅觉丧失。我们的研究结果支持病毒衍生蛋白如SARS-CoV-2 S RBD可能具有神经毒性作用的观点。本研究提出了与宿主感染 SARS-CoV-2 后 S1 和 S1 衍生蛋白片段的生化相互作用有关的重要问题。如果RBD或其他S1片段在体内释放，游离病毒蛋白的存在可能会导致或加剧病毒病理生理损伤。进一步的研究可以为这一假说提供实验支持。
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