环境内分泌干扰物暴露会危害男性健康生殖功能。环境内分泌干扰物普遍存在于杀虫剂和除草剂中，同时也可以通过食品包装材料泄露于环境之中。环境内分泌干扰物可在人体组织和血液中积累，并达到稳定浓度；有研究发现，环境内分泌干扰物可模拟内分泌激素的作用，进而导致体内激素分泌、合成障碍。邻苯二甲酸二辛酯（DEHP）是一种广泛运用的环境内分泌干扰物，已被证明会导致男性生殖功能障碍。当下流行病学研究表明，DEHP暴露可引起男性精子质量下降。孕期DEHP暴露可诱发子代患隐睾和尿道下裂。但DEHP刺激引起睾丸细胞功能障碍的机制尚未完全探明。                      

2021年12月，重庆医科大学附属儿童医院泌尿外科吴盛德课题组在Journal of Hazardous Materials发表了题为“Di-(2-ethylhexyl) phthalate exposure leads to ferroptosis via the HIF-1α/HO-1 signaling pathway in mouse testes”的论文。论文第一作者为吴雨昊博士研究生。

 一、研究思路

01 体内外验证DEHP刺激可导致睾丸损伤。

02 组学分析与实验验证得出HIF-1α等信号通路出现异常。

03 探索HIF-1α信号通路的作用机制。

04 体外敲除HIF-1α进一步验证HIF-1α的作用。                       

二、结果

⭐ 体内验证DEHP刺激可导致睾丸损伤

小鼠服用DEHP后，作者通过HE染色发现生殖细胞脱落、细精管层数减少的现象，证明了DEHP可导致睾丸损伤。利用RNA-Seq，检测服用DEHP的实验组和未服用DEHP的对照组。经过GO分析，发现差异表达的基因与氧化应激和铁代谢相关。同时KEGG分析筛选到与铁离子代谢相关的ferroptosis途径和谷胱甘肽代谢途径。通过进一步的分析，发现HIF-1信号通路也受到了影响。接下来，作者开展了一系列实验，结果均与RNA-seq的分析吻合。至此，作者已经明确：在DEHP处理后，体内亚铁离子的浓度上升、脂质过氧化反应增强、铁离子代谢相关的蛋白表达发生改变和HIF-1α表达增加，最终导致睾丸损伤。                               

⭐ 体外验证MEHP刺激可加速细胞死亡

作者在体内验证了DEHP与睾丸损伤有相关性后，接着在体外进行验证，发现体外实验的结果与体内的一致。MEHP是DEHP的主要生物代谢物，能替代DEHP用于体外实验。作者使用MEHP作为DEHP的替代物，处理TM3间质细胞系（TM3 Leydig cell line）TM4支持细胞系（TM4 Sertoli cell line），发现能加速两种细胞系的死亡。与体内实验思路相似，将对照组和实验组进行RNA-Seq，通过GO分析发现差异表达的基因与氧化应激和铁稳态相关。KEGG 分析也发现ferroptosis途径、谷胱甘肽代谢途径和HIF-1 信号通路受到影响。并且RNA-seq的分析结果也得到了实验的验证。所以，作者体外的实验结果表明：在MEHP刺激后睾丸间质细胞和支持细胞后的ROS显著增加、包括Hmox1等铁离子代谢相关的基因表达模式发生改变、亚铁例子的浓度上升和线粒体形态异常。                            

⭐ HIF-1α 通过调控HO-1的表达影响亚铁浓度

接着，作者开展机制探讨。通过分析HIF-1信号通路相关的差异表达基因，发现编码 PHD 的 Egln1 、 Egln3 在 MEHP刺激后下调。而PHD 复合物通常会降解 HIF-1α，并且通过 RT-qPCR 和WB检测也验证 Egln1、Egln2 和 Egln3 与HIF-1α 和 HIF-1β的表达模式相反。接着通过分离了 Leydig 和 Sertoli 细胞的细胞质蛋白和核蛋白，发现MEHP 的刺激会影响 HIF-1α 稳定性和积累，发现ME，导致 HIF-1α 从细胞质易位进入细胞核。接着通过 ChIP-qPCR 分析，发现 HIF-1α 可以与 Hmox1 的启动子结合，调控HO-1（由 Hmox1 编码）的表达。最终由于HO-1的表达上调，导致亚铁浓度上升。                               

⭐ 体外敲除HIF-1α进一步验证HIF-1α的作用

通过上述的一系列实验，作者筛选到与睾丸细胞损伤相关的基因：HIF-1α，并且初步发现其调控机制。为了进一步确认这一结果，作者构建了 HIF-1α基因敲除的 Leydig 和 Sertoli 细胞系（HIF-1α基因敲除的 Leydig 和 Sertoli 细胞系，由赛业生物提供），用于后续的实验。通过Sanger测序和Western blotting检测，确认了敲除细胞系中的HIF-1α被成功敲除。在 与野生型细胞相比，HIF-1α-KO的细胞系在MEHP刺激下细胞活力受损的程度有明显改善。同时，脂质过氧化（图1b，I）和亚铁超载（图1c，J）也受到抑制。分别使用qPCR和Western印迹法评估Hmox1和HO-1水平的表达，发现敲除Hif-1α能逆转MEHP刺激下的Hmox1（图1d，K）和HO-1（图1g，N）表达水平上调。此外，MEHP刺激后ROS爆发（图1E，L）和细胞死亡（图1F，M）程度也在敲除HIF-1α后减弱。Western印迹显示敲除HIF-1α恢复了ACSL4、FTH1和SLC7A11的表达，以及抑制GPX4的表达（图1 G，N）。总的来说，这些结果表明，MEHP刺激以HIF-1α依赖的方式导致睾丸 Leydig 和 Sertoli 细胞的铁死亡。

图 1 HIF-1α基因敲除挽救了MEHP诱导的铁死亡                             

三、总结

作者通过MEHP刺激后的表型分析、RNA-Seq分析、ChIP-qPCR 分析等发现与睾丸细胞功能障碍相关的调控基因：HIF-1α。并初步发现其调控机制：MEHP（体内DEHP的主要生物代谢物）可抑制PHDs，影响HIF-1α积累和稳定，导致HIF-1α易位到细胞核，并诱导 Leydig 和 Sertoli 细胞中HIF-1/Hmox1结合，使HO-1的表达上调。HO-1的过表达导致亚铁超载，ROS积累，最终导致铁死亡，损伤Leydig 和 Sertoli 细胞的活性。这一结果，进一步在HIF-1α基因敲除的细胞系得到验证。                                

四、参考文献：

Wu Y, et al. Di-(2-ethylhexyl) phthalate exposure leads to ferroptosis via the HIF-1α/HO-1 signaling pathway in mouse testes. 2021, 127807. DOI: https://doi.org/10.1016/j.jhazmat.2021.127807