将脲溶性牛黑素相关抗原(BMAA)加完全弗氏佐剂和百日咳杆菌分别免疫Lewis、F344及Wistar大鼠,诱导实验性自身免疫性葡萄膜炎。
1.模型制作方法 Lewis大鼠,6~8周龄,体重150~180g,雌雄各半;F344大鼠,6~8周龄,体重150~180g,雌性;Wistar大鼠,6~8周龄,体重150~180g,雌性。
(1)抗原制备:从牛虹膜、睫状体中提取BMAA,并用8mol/L脲溶解BMAA,置4℃冰箱过夜后,低温高速离心,取其上清液用双蒸馏水透析48h,真空冷冻干燥48h,放于一80℃冰箱中备用。
(2)动物免疫方法:模型组每只动物用100μg脲溶性牛黑素相关抗原进行1次免疫,将所需抗原的一半剂量50μg用磷酸盐缓冲液(PBS)30μl稀释,加等量完全弗氏佐剂混合,作右后足垫皮下注射,另一半抗原用PBS 70μl稀释,再加30~70μl百日咳杆菌原液(1.12×1010个/ml)混合,作腹腔内注射。空白对照组于右后足垫皮下注射PBS 60μl,于腹腔注射PBS 100μl。
2.观祭指标与分析
(1)炎症判断标准及症状观察:大鼠于免疫前1d及免疫后第7天起每天进行裂隙灯显微镜检查,记录症状表现。1级,轻度睫状充血,角膜透明,Tyndall征(房水闪辉现象)(+~++),细胞(+),虹膜血管轻度扩张;2级,睫状充血明显,角膜透明,Tyndall征(+++),细胞(++),虹膜血管明显扩张,瞳孔领区有少许絮状渗出;3级,角膜轻度水肿,前房出现纤维凝块,虹膜血管极度扩张,瞳孔部分后粘连;4级,角膜明显水肿,前房积脓或虹膜表面大量渗出,瞳孔后粘连或晶体表面有膜样渗出物。Lewis大鼠和F344大鼠均能又诱发出实验性自身免疫性葡萄膜炎,二者开始发病时间和炎症严重程度类似,而Wistar大鼠诱发率低,只有76.9%开始发病时间较迟,炎症改变较轻。
(2)病理学检查:Lewis大鼠、F344大鼠免疫后第18天,角膜水肿,前房出现大量炎症细胞(淋巴细胞、巨噬细胞及分叶核细胞)积聚及蛋白样渗出,虹膜、睫状体水肿,有大量炎性细胞浸润,后房也出现炎症细胞及渗出物,脉络膜有局灶性炎症改变,但视网膜和松果体未发现炎症改变,28d后炎症基本消失。Wistar大鼠免疫后第14天出现轻度炎症改变,表现为虹膜血管扩张、虹膜表面有渗出物,睫状体有少量炎症细胞浸润。轻度者炎症持续4~5d后逐渐减退;严重者炎症继续发展,高峰期于免疫后第18~21天,以后炎症逐渐减弱,28d基本恢复正常。重度炎症改变基本同Lewis和F344大鼠,但是脉络膜未见炎性改变,视网膜及松果体也无炎性改变。以上3种大鼠的佐剂对照及空白对照组均未发现炎症改变。