影响rAAV实现体内基因操作实验结果关键:实验操作对注射效果影响

来源:赛业生物 发布时间:2022年06月06日 浏览次数: 【字体: 收藏 打印文章

影响rAAV实现体内基因操作实验结果的关键

 

在基因治疗靶点发现和药物开发的过程中,如何将基因片段高效、精准地递送到目的组织器官中,且不引起机体免疫、脱靶效应等副作用,是目前需要攻克的一大技术难点。科研人员经过开展大量的研究后,形成了两大类递送系统:病毒载体和非病毒载体。其中rAAV病毒载体是现今最常用、被认为最有应用前景的递送载体。这是由于rAAV具有免疫原性低、靶向性强、宿主范围广、可长期稳定地表达外源基因、安全性高和物理性质稳定等优点。因此,rAAV常用于体内基因操作实验。

 

以rAAV作为递送系统,开展一次成功的体内基因操作实验并不容易。因为rAAV血清型的选择、载体设计、rAAV的生产质量、注射方式、剂量的选择和实验操作等因素决定了实验的成功与否。下面与大家一同回顾rAAV体内基因操作实验的关键细节。

 

一、血清型与启动子选择是前期实验方案设计中的关键

为了实现目的基因在特定的组织中高效表达,需要前期做好实验规划。其中最为关键的是需要选择合适的血清型和启动子。由于rAAV的吸附,入侵,胞内运输,蛋白酶体降解,入核,脱衣壳等步骤都与衣壳蛋白相关,因此血清型的结构决定rAAV的侵染效率和靶向特异性等基本能力。我们可以根据实验需求选择合适的血清型。下表是由赛业生物整理的常见血清型的组织靶向性总结,供大家参考。

 

影响rAAV实现体内基因操作实验结果的关键

 

特异性启动子能使目的基因在特定的组织和细胞类型中表达,因此我们可以选用特异性启动子,进一步提高目的基因递送的特异性。可以选用一些被改造的特异性启动子,如融合了增强子序列的特异性启动子,这些特异性启动子往往在保证组织特异性的同时也具备较高的启动活性。同时尽量选用较短长度的启动子,以此扩大目的基因的装载容量。下表是由赛业生物整理的常见特异性启动子及其靶向性总结,供大家参考。

 

影响rAAV实现体内基因操作实验结果的关键

 

二、专业的实验操作对注射效果有重要影响

 

选择合适和血清型和设计合适的载体只是实验成功的基本前提,而注射方式、注射剂量和实验操作等,这些因素也对我们实验的成败有着重要的影响。

 

在注射方式上,分为系统性注射和局部注射。系统性注射又包括尾静脉注射、腹腔静脉注射、眼眶静脉注射和颈静脉等。局部注射方式常见的包括脑立体定位注射、肌肉定点注射、心肌原位注射、玻璃体腔内注射、关节腔注射等。系统性注射操作简单,但由于需要依赖病毒在体内随机扩散到达靶组织,因此其病毒用量较大。局部注射所需的病毒量较少,一般100ul以内,但对滴度要求较高。由于是直接将rAAV注射到目标组织中,因而局部注射会有更好的靶向性。我们可以根据实际的需求来选择合适的注射方式,下表是赛业生物整理的针对常见注射部位的有效注射方法,供大家参考。

 

影响rAAV实现体内基因操作实验结果的关键

 

在实际操作过程中,我们需要详细了解操作步骤和注意细节。特别是一些具有难度的局部注射的方法,这些方法往往涉及开腹、寻找微组织等操作,对实验条件和操作手法要求较高,稍有失误,小鼠便会有较大的损伤,最终影响实验结果。下面给大家介绍几个注射方式的难点及注意细节。

 

01.乳鼠颞静脉注射

1体积小:刚出生的乳鼠体重仅有1g左右;

2血管细:颞静脉细如一根线,分布在耳前深部,若隐若现;

3麻醉难:新生乳鼠无法通过麻醉药物麻醉,需冰冻麻醉,冰冻时间过短无法麻醉,冰冻时间过长乳鼠会死亡;

4护理难:乳鼠注射后需及时保温,同时母鼠有可能因为乳鼠的气味变化,出现不哺育甚至吃掉幼崽。

 

影响rAAV实现体内基因操作实验结果的关键

图1. 乳鼠颞静脉注射

 

02.脑立体定位注射

1坐标变化大:大小鼠成年前脑部不断发育,脑区坐标也在不断变化;

2注射位点多:脑部可注射的位点包括海马体、侧脑室、第三脑室、纹状体等,即使注射同一区域坐标也不固定;

3体位固定难:大小鼠通过鼻夹、耳棒等工具保定头部,还需进行多次调平方可开始定坐标;

4颅骨钻孔难:需用专门的颅钻及适配的钻头对颅骨进行打孔,打孔转速过低难以钻穿颅骨,转速过高会钻穿脑膜,导致脑部出血。

 

影响rAAV实现体内基因操作实验结果的关键

图2. 脑立体定位注射

 

03.肝门静脉注射

1操作复杂:需进行腹部手术,将肠道移出腹腔,肝脏及胰腺易损,动作轻柔,找到肝门静脉;

2易渗血:肝门静脉较大且充盈,穿刺血管给药容易导致血管不可逆的损伤,出现持续性渗血或爆发性出血,降低存活率。

3护理难:术中存在感染风险,术后需注射抗生素,并保温至动物苏醒。

 

04.气管内注射

1无创插管难:经口腔插入小鼠气管需有一定的技巧性,插管失败易导致喉头肿胀或误插食管;

2有创注射损伤大:暴露气管需颈部开口,导致气管上方肌肉撕裂,钢针刺入也会导致气管损伤、小鼠呼吸不畅。

 

05.尾静脉注射

尾静脉注射失败易导致病毒在尾部残留,影响整体病毒注射量和成像结果(如图3第4只小鼠)。

 

影响rAAV实现体内基因操作实验结果的关键

图3. 尾静脉注射

 

三、结语

一次成功的rAAV体内的基因操作实验,需要考虑多方面的因素。前期需要查阅大量的资料选择血清型和启动子,设计合理科学的方案,并生产出高滴度高感染效率的rAAV。此外拥有熟练的实验操作技能和专业素养,才能有效地将rAAV递送至体内,从而有效实现目的片段的表达。

 

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