斑马鱼仔鱼模型：研究组织中性粒细胞功能
摘要：适当的中性粒细胞功能对于先天免疫防御和避免炎症病理至关重要。中性粒细胞可以根据环境调整它们的反应，最近，健康和疾病中都证实存在多个不同的中性粒细胞群。然而，在其组织环境中对中性粒细胞功能进行研究仍然具有挑战性，例如，中性粒细胞成熟度与功能之间的关系尚不完全清楚。许多中性粒细胞形态和功能特征在哺乳动物和非哺乳动物脊椎动物之间高度保守。 这使得可以使用透明且遗传易处理的斑马鱼仔鱼来研究中性粒细胞生物学成为可能。我们回顾了斑马鱼仔鱼中性粒细胞发育和功能的数据，以及斑马鱼为中性粒细胞生物学研究带来的进展。此外，我们讨论了使用斑马鱼仔鱼模型时要考虑的层面，以进一步增强我们对中性粒细胞在健康和疾病中的功能的理解。
关键词：斑马鱼 中性粒细胞 炎症 疾病模型
简介：中性粒细胞是人类最丰富的白细胞，在抵抗感染的第一道防线中起着至关重要的作用。此外，中性粒细胞发育或功能缺陷是许多严重免疫缺陷症的诱因。中性粒细胞功能失调也与各种炎症病理有关。近年来，人们认识到，中性粒细胞除了具有经典定义的微生物杀灭功能（即吞噬、脱颗粒和坏死）外，还通过产生细胞因子以及与其他免疫和非免疫细胞的相互作用发挥多种细胞功能。最近的证据表明，中性粒细胞可以根据其微环境表达不同的表型。此外，单细胞基因表达技术揭示了健康和疾病中的多个中性粒细胞亚群。通过免疫基因组 (ImmGen) 项目对健康或炎症组织中的中性粒细胞进行最新 scRNAseq 分析，研究人员提出，在健康条件下，来自多个组织的所有中性粒细胞状态都可以投射到一个单一的连续体上，称为 Neutrotime。来自发炎组织的中性粒细胞会根据来源组织和使用的炎症刺激物偏离 Neutrotime 形成新的簇，突出了组织微环境在调节中性粒细胞表型和功能中的重要性。因此，中性粒细胞功能最好在组织微环境中进行体内研究。在过去的二十年里，斑马鱼已被广泛用作阐明疾病机制的生物医学研究模型，这很大程度上归功于胚胎的透明度和可用的遗传工具。成年斑马鱼的免疫系统发育完善，其功能性T细胞和B细胞谱系与哺乳动物相当，而在受精后3-4周，仔鱼的先天免疫系统主要由巨噬细胞和中性粒细胞组成。自2006年第一只带有荧光标记中性粒细胞的报告斑马鱼诞生以来，斑马鱼仔鱼模型已被广泛用于研究中性粒细胞在感染、炎症、组织修复和癌症中的功能。例如，正如Huttenlocher实验室最初在仔鱼尾鳍创伤模型中所描述的那样，中性粒细胞的反向迁移有助于炎症的缓解，后来在小鼠上得到了证实。中性粒细胞反向迁移现在被认为是炎症消退的一个重要方面，并且可能是一种将炎症信号传播到远端器官的机制。
斑马鱼仔鱼中性粒细胞的形态特征表明，它们可能是一个异质群体，其亚群可能不是完全成熟的中性粒细胞。因此，在选择斑马鱼仔鱼模型来研究特定疾病机制时，需要仔细考虑斑马鱼仔鱼中性粒细胞和哺乳动物中性粒细胞之间的异同。我们回顾了斑马鱼仔鱼中性粒细胞发育和功能的数据，特别注意在哺乳动物中性粒细胞系统中建立其最接近的对应物。根据现有证据，我们将讨论斑马鱼仔鱼为推进中性粒细胞生物学提供的机会。
斑马鱼仔鱼中性粒细胞的起源和寿命：在哺乳动物中，中性粒细胞是由造血干细胞 (HSC) 衍生的粒细胞祖细胞在骨髓 (BM) 中产生的。 成熟的中性粒细胞不断释放到血液中，循环中的中性粒细胞通过迁移对炎症信号作出反应，即离开血流进入组织微环境，发挥多种功能。在斑马鱼仔鱼中，中性粒细胞是由原始造血和最终造血产生的。 原始造血发生在受精后 24 小时内 (hpf)。随后，在后血岛（PBI）中产生由红骨髓祖细胞（EMP）衍生的中性粒细胞。以髓过氧化物酶（mpo）作为泛中性粒细胞标记物，苏丹黑（SB）染色作为成熟中性粒细胞标记物，在24hpf时，仅检测到mpo+/SB-未成熟中性粒细胞，而在35hpf中可检测到第一个成熟的SB+中性粒细胞。在稳态条件下，到 48hpf，所有中性粒细胞均为 mpo 和 SB 双阳性，表明其完全成熟状态。受精后 2-3 天 (dpf) 中性粒细胞开始从位于背主动脉 (VDA) 腹壁的 HSC 中产生中性粒细胞，相当于哺乳动物中的主动脉-性腺-中肾 (AGM)。HSCs 迁移到尾部造血组织（CHT，哺乳动物胎肝的对应物），成为仔鱼发育过程中中性粒细胞产生的主要场所。VDA 和 CHT 产生的中性粒细胞被称为“仔鱼粒细胞”以区别于原始中性粒细胞，并且被认为与成体造血产生的中性粒细胞相似。到 5 dpf，HSC 到达肾骨髓，在动物的整个生命周期中，中性粒细胞由 HSC 衍生的祖细胞产生，这是一个类似于哺乳动物骨髓造血的过程。
图1：斑马鱼中性粒细胞的发育。
Le Guyader等人使用谱系追踪仔细分析了48hpf处粒细胞的起源，并证明原始来源和最终CHT来源的中性粒细胞共存。有趣的是，在48hpf-72hpf之间，尽管原始髓系祖细胞不再存在，在缺乏确定性造血功能的突变仔鱼中，原始衍生成熟中性粒细胞的数量翻了一番，这表明成熟的原始中性粒细胞在 3dpf 之前保持增殖能力，或者有更多未成熟的中性粒细胞在 2-3 dpf 之间达到成熟。哺乳动物中性粒细胞增殖尚未被描述。耐人寻味的是，在中性粒细胞中，细胞周期标记物被激活，表明在成熟的中性粒细胞中有能力启动有丝分裂信号。由于原始中性粒细胞仅在 48hpf 之前的短时间内产生，因此这些细胞的寿命决定了它们在仔鱼中的持续时间。使用光转换荧光蛋白标记和测量斑马鱼仔鱼组织中性粒细胞在 3dpf 的半衰期的研究证据表明，仔鱼组织中的中性粒细胞的寿命为 5 天。然而，在整个测量过程中，标记细胞的数量没有增加，这就提出了一个问题，即原始中性粒细胞是否在3dpf以外保持增殖潜能。然而，在仔鱼生命的第一周，原始中性粒细胞可能会在仔鱼组织中持续存在。由于大多数使用斑马鱼仔鱼研究中性粒细胞功能的研究都在此时间范围内，因此研究人员将研究混合的原始和最终衍生的中性粒细胞群的功能，尽管没有证据表明原始中性粒细胞在功能上与最终衍生的中性粒细胞不同。假定来自骨髓的循环中性粒细胞的半衰期仅为 6-12 小时，尽管在人类中长达 5 天。人体组织中的中性粒细胞被认为寿命更长，但这一点一直难以测量。大多数离开斑马鱼仔鱼造血部位的中性粒细胞存在于组织中，只有少数存在于循环中。在斑马鱼仔鱼中测量的中性粒细胞寿命可能反映了在哺乳动物系统中看到的类似情况。 这表明斑马鱼仔鱼中性粒细胞与哺乳动物组织中性粒细胞相当。在哺乳动物中，中性粒细胞的产生随着炎症信号的增加而增强。所有现有的中性粒细胞都会在对抗细菌的过程中死亡，而HSC衍生的中性粒细胞生成过多，从而增强了炎症信号和抗菌功能。因此，这将斑马鱼仔鱼作为相关模型来研究调节需求驱动的粒细胞生成的机制以及感染后组织中补充的中性粒细胞的功能。
斑马鱼仔鱼中性粒细胞的核形态特征及成熟：中性粒细胞是快速移动的细胞，能够通过非常狭窄（~1 μm）的内皮通道迁移到组织中，这在斑马鱼仔鱼中也可以观察到。这需要细胞直径和核形态的动态变形，这是通过核膜的特定组成来实现的。多形核是人和小鼠成熟中性粒细胞的特征，斑马鱼中性粒细胞中也可见多形核。
成年斑马鱼的肾脏和脾脏含有处于不同发育阶段的中性粒细胞，包括具有大而圆的细胞核和弥漫的核染色质的早幼粒细胞，以及具有2或3个叶的分叶核的成熟中性粒细胞。在仔鱼斑马鱼中，大多数中性粒细胞有肾形核，约15-25%有双叶核，很少有多叶核。这些形态学特征表明，许多仔鱼中性粒细胞是不成熟的，然而，尚未系统地对在2-5dpf之间仔鱼中性粒细胞进行核形态与其他成熟标记物（如苏丹黑信号）的直接关联研究。由于易于进行遗传操作，可以在斑马鱼中探索调节中性粒细胞发育和成熟的机制。 与哺乳动物相比，参与中性粒细胞发育的关键途径在斑马鱼中是保守的，许多研究将分析重点放在造血发育中产生的中性粒细胞的比例上。仔鱼生命最初 48 小时内原始中性粒细胞的发育与 HSC 无关，这为揭示 HSC 规范转录因子 Runx1、cmyb 和 Cebp1 在中性粒细胞成熟中的功能作用提供了机会。用改变的核形态或中性粒细胞颗粒形成来评估中性粒细胞成熟表型。除了已知的中性粒细胞成熟相关基因外，还发现了新的调节因子。Lian等人表明血红素生物合成途径的关键酶 5-氨基乙酰丙酸合酶 1 (ALAS1) 是中性粒细胞成熟和正常功能所必需的。 .Wu等人研究显示在 Gfiaa 突变鱼中，中性粒细胞祖细胞过度增殖和扩张，导致从仔鱼阶段开始积累具有肾形细胞核的未成熟中性粒细胞。相反，删除 miR-142-3p 导致胚胎中的中性粒细胞数量减少，但中性粒细胞成熟度增加，其中更多的中性粒细胞具有双叶或多叶核。 这些中性粒细胞在迁移到炎症部位方面也存在缺陷。班克斯等人。 表明表观转录组机制可以通过使 socs36b mRNA 去甲基化的 Tet 蛋白调节中性粒细胞成熟，从而导致其降解。Tet2/3 突变导致细胞因子信号传导受到抑制，包括 JAK/STAT 信号传导，这导致 3dpf 仔鱼和成年斑马鱼的中性粒细胞粒化和吞噬作用缺陷，尽管仍然能正常迁移到伤口。尽管如此，这些研究表明，高分叶中性粒细胞迁移能力差，但吞噬功能正常，而低分叶中性粒细胞在粒化和吞噬功能方面有缺陷，但迁移良好。有一些证据表明哺乳动物中性粒细胞的核形态和功能之间存在类似的联系，但直接针对所有这些属性的研究仍然有限且无定论。斑马鱼为实时成像提供了极好的遗传工具和特性，从而有助于在相关的体内环境中剖析中性粒细胞核形态、迁移和功能之间的关系。
斑马鱼仔鱼中性粒细胞的功能特征：斑马鱼仔鱼已被广泛用于模拟各种人类炎症病理，包括病毒、细菌和真菌感染、创伤和癌症。这使得研究中性粒细胞生物学的几个功能方面成为可能，包括吞噬、坏死、迁移和炎症消退，揭示了人类和斑马鱼之间保守的功能机制以及一些新发现，从而突出了斑马鱼仔鱼作为体内中性粒细胞功能研究模型的相关性。
中性粒细胞效应器功能：通过吞噬作用清除病原体和受损组织对宿主防御和组织修复至关重要。同时带有荧光标记细菌的荧光转基因报告鱼系能够在体内实时成像感染和伤口愈合期间中性粒细胞的吞噬作用。Colucci-Guyon 等人证明中性粒细胞是立即反应者并吞噬体腔中的表面相关微生物，而巨噬细胞是清除血液中病原体的主要参与者。几个例子表明斑马鱼仔鱼的中性粒细胞吞噬功能对于控制感染至关重要。然而，在某些情况下，中性粒细胞不会杀死被吞噬的细菌，而是可以为细菌传播提供细胞内生态位。在斑马鱼仔鱼无菌组织损伤中也观察到中性粒细胞吞噬行为，如伤口和肿瘤发生；然而，这种行为的功能性后果还不清楚。中性粒细胞脱粒和 ROS 产生是吞噬体内或细胞外病原体清除的两个主要效应功能。 例如，斑马鱼仔鱼中性粒细胞可以吞噬并使用 NADPH 氧化酶杀死受感染巨噬细胞中的分枝杆菌。据报道，中性粒细胞在志贺氏菌感染中具有类似的清除作用。中性粒细胞也可以在不直接接触的情况下利用氧化机制消除病原体，Phan等人在大肠杆菌脊索感染模型中已经证明了这一点。
中性粒细胞胞外陷阱 (NETs)：成熟活化的中性粒细胞的防御功能之一是释放中性粒细胞胞外陷阱（NETs），它是由DNA和组蛋白以及颗粒蛋白组成的纤维结构。除了纯粹的抗菌功能外，在哺乳动物中，NETs 已被证明在各种生理条件下发挥作用，例如癌症和心血管疾病。有报道称，成年鱼和斑马鱼仔鱼在受到创伤和细菌或真菌感染后会形成NETs。在斑马鱼仔鱼中，NETs的形成与成群反应中的早期中性粒细胞DNA释放有关。体外试验人中性粒细胞对白色念珠菌的反应也存在类似的联系。在感染的情况下，NETosis 似乎与中性粒细胞焦亡有关，并且是有效清除斑马鱼仔鱼中细菌或真菌病原体所必需的。因此，可以进一步利用斑马鱼作为模型来研究 NETosis 在各种病理性炎症条件下的功能，以确定斑马鱼 NETs 在功能上是否与哺乳动物中的 NETs 同源。因此，斑马鱼仔鱼中性粒细胞似乎概括了它们的哺乳动物对应物在防御病原体方面的大部分功能方面。然而，由不同造血波产生的中性粒细胞可能的功能差异仍然难以捉摸。如果没有一个明确的报告来区分不同成熟度的中性粒细胞，那么确定成熟与不成熟中性粒细胞的功能贡献也是一个挑战。一般来说，斑马鱼仔鱼在 1-2 dpf 后变得更有能力抵抗感染，因为它们的中性粒细胞已经分化。
中性粒细胞募集及其在伤口愈合和再生中的作用：中性粒细胞是高度运动的细胞，虽然哺乳动物模型中的活体成像设备正在改进，但透明斑马鱼仔鱼已经被广泛用于研究中性粒细胞向损伤部位的迁移和随后的炎症消退，称为反向迁移。斑马鱼仔鱼受伤后，首先通过从伤口释放的趋化信号从邻近组织募集中性粒细胞。相比之下，在人类中，来自 BM 的中性粒细胞动员是罕见的事件。 在稳态下，大多数成熟的中性粒细胞保留在 BM 中。另一方面，即使在没有炎症的情况下，中性粒细胞也会渗透到组织中，这表明它们在维持组织内稳态方面发挥作用。然而，组织中性粒细胞的作用以及调节其募集和保留的机制尚不完全清楚。斑马鱼仔鱼中的中性粒细胞主要驻留在组织中，因此为研究中性粒细胞在组织中的迁移和功能提供了机会。尾鳍损伤试验已被广泛用于研究调节中性粒细胞趋化性迁移的信号，最近还用于描述中性粒细胞聚集。中性粒细胞聚集到受损组织可分为三个阶段（1）单个中性粒细胞对损伤部位的初始趋化性，随后（2）远处中性粒细胞趋化性增强，导致（3）中性粒细胞聚集。哺乳动物模型的研究表明，由于有效的旁分泌信号，中性粒细胞聚集既是自我放大又是自我限制的过程，使中性粒细胞有时间在募集和防御模式之间切换。斑马鱼活体成像研究表明，到达坏死组织的中性粒细胞能感知损伤信号 ATP，从而触发一波钙警报信号。该信号通过连接蛋白 43 (Cx43) 半通道以接触依赖性方式传播，从而触发化学引诱信号的合成。近年来，中性粒细胞在组织修复过程中的功能受到重视。尽管需要更多的研究来充分阐明中性粒细胞在不同组织修复过程中的功能作用，但似乎中性粒细胞通过调节受损组织内的多种细胞类型发挥其促修复功能。因此，使用多个标记中性粒细胞和其他相关细胞的报告基因来研究中性粒细胞如何与局部组织内的不同细胞类型相互作用是有利的。
肿瘤中的中性粒细胞功能：中性粒细胞是各种肿瘤和肿瘤微环境中最常见的炎症细胞类型，即使在早期阶段也是如此，它们的肿瘤内高密度通常与预后不良有关。肿瘤相关中性粒细胞（TAN）被分类为促炎性和抗肿瘤性N1或促肿瘤性N2，IFNβ和TGFβ被认为是决定其表型的关键因素。然而，在癌症中，在血液和组织中发现了表现出一系列成熟状态的中性粒细胞，它们的成熟度和功能之间的联系仍然知之甚少。对转基因斑马鱼肿瘤模型的研究揭示了对转化细胞的早期炎症反应，表明中性粒细胞被各种组织中的转化细胞迅速吸引，包括皮肤、肝脏和大脑。此外，涉及中性粒细胞耗竭或抑制的研究表明，这些细胞在肿瘤发生过程中具有促瘤作用，尽管在结直肠癌异种移植模型中有助于肿瘤清除。与哺乳动物的数据一样，TGF-β似乎可以吸引中性粒细胞进入转化的肝细胞，甚至在肿瘤发生时也可以促进免疫抑制。在哺乳动物和斑马鱼体内，参与中性粒细胞向伤口和炎症部位募集的几种细胞因子和其他介质也介导中性粒细胞向转化细胞和肿瘤微环境（TME）的募集，包括TNFa、IFN1、CXCR1和CXCR2受体、IL8和H2O2。此外，斑马鱼中性粒细胞表达多种免疫抑制和营养基因以响应转化细胞，炎症介质前列腺素E2（PGE2）由一部分中性粒细胞产生。后一发现表明斑马鱼中性粒细胞可以对转化细胞产生异质反应，尽管到目前为止，尚未在斑马鱼肿瘤模型中定义不同的中性粒细胞亚群。许多中性粒细胞对转化细胞的反应似乎在哺乳动物和鱼类之间是保守的。
结论和展望：在过去十年中，斑马鱼仔鱼模型对我们了解在感染、炎症、组织损伤和癌症中调节中性粒细胞功能的机制做出了重大贡献。斑马鱼和哺乳动物中性粒细胞的个体发育和成熟途径之间存在同源性。斑马鱼仔鱼为研究正常和病理组织条件下的中性粒细胞功能提供了理想模型。此外，斑马鱼仔鱼的繁殖数量大和小体型为体内全身药物筛选抗炎药提供了机会。利用多宿主免疫细胞和病原体标记，对感染模型进行详细的体内成像分析和转录组分析，将有助于深入了解宿主/病原体相互作用中调节中性粒细胞功能的机制。原始中性粒细胞在斑马鱼仔鱼出生后的第一周内持续存在，目前，它们与最终造血产生的中性粒细胞无法区分，可能有助于斑马鱼仔鱼模型中描述的中性粒细胞功能。到目前为止，中性粒细胞在疾病模型中的功能主要通过消耗或通过抑制中性粒细胞募集到发炎组织中来研究。 在过去几年中，中性粒细胞特异性 CRISPR/CAS9 基因编辑系统进一步丰富了斑马鱼体内中性粒细胞功能研究的工具箱，从而可以研究中性粒细胞中的单个基因功能。在健康条件下与疾病模型相比，仔鱼与成虫中性粒细胞的单细胞 RNA 序列分析将成为斑马鱼中性粒细胞生物学的宝贵资源。 非侵入性体内实时成像是使用斑马鱼仔鱼模型的优势之一。非侵入性体内实时成像是使用斑马鱼仔鱼模型的优势之一。在未来几年，更多的工具将进一步增强斑马鱼仔鱼模型研究组织中性粒细胞功能的能力。
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