一、杂交瘤技术

1975年，克勒（Kohler）和米尔斯坦（Milstein）将小鼠骨髓瘤细胞和经免疫的小鼠脾细胞进行融合，获得了既可产生单克隆抗体又可无限增殖的杂交瘤细胞。迄今为止，杂交瘤技术已发展非常成熟，是目前制备抗体应用最广泛的技术，在已批准上市的治疗性抗体中，多数来自于杂交瘤小鼠。 

通过杂交瘤技术获得单克隆抗体的技术流程大致为：

(1）选择合适抗原免疫动物（一般为小鼠）；

(2）分离小鼠脾脏细胞并与骨髓瘤细胞融合；

(3）筛选杂交瘤细胞获得分泌目标抗体的阳性单克隆杂交瘤细胞；

(4）扩大培养阳性单克隆杂交瘤细胞；

(5）体外培养或体内诱生法获得大量的单克隆抗体。

图2 杂交瘤技术制备抗体流程 

杂交瘤的整个过程具有一定的复杂性和技巧性，例如在免疫动物的过程中，通常在注射抗原时使用佐剂，从而避免非特异性的免疫反应将抗原快速分解，达到抗原缓慢释放并作用免疫系统，最终提高产生亲和性较高抗体的效率；再比如，作为单克隆抗体制备过程中最为关键的一个环节，细胞融合率直接影响抗体的制备，特别是对于小鼠脾脏的处理，更要十分小心，稍不注意就会影响最终的融合效率。 

杂交瘤技术可确保不同批次制备的抗体质量相同，更加易于复制，是一种高效的抗体制备技术。但传统的杂交瘤得到的是鼠源抗体，如不进行人源化改造，进入人体内会产生针对鼠抗的抗体（Human Antimous Antibody，HAMA），HAMA不仅会导致抗体被快速清除，缩短半衰期进而影响疗效，严重则引发严重免疫反应，存在安全性风险，因此鼠源抗体需经过复杂的人源化改造才可用于临床上治疗。另外，鼠源抗体的可变区难以与人类抗原交互，诱发ADCC的效应相对弱，因此无法有效杀灭目标。 

因此近年来，人源抗体越来越受到关注，并成为未来的发展方向。根据人源比例和部位不同可进一步为三大类:

(1) 人鼠嵌合单抗：恒定区来自人类，可变区来自小鼠（鼠源成分~35%）；

(2) 人源化单抗：恒定区来自人类，可变区为人鼠序列结合（鼠源成分~10%）；

(3) 全人源化单抗：恒定区及可变区均来自于人类（鼠源成分0%）。 

图3 不同人源抗体的人源化程度 

近年来，越来越多的全人源抗体药物获批上市，截至目前已经有36款全人源抗体获批上市，例如2021年5月上市的Amivantamab（杨森生物）是一种靶向c-MET/HGFR和EGFR的双特异性抗体，对于EGFR突变的非小细胞肺癌具有良好的治疗效果。目前，制备人源抗体常用的技术有噬菌体展示技术和转基因小鼠杂交瘤技术。 

二、噬菌体展示技术

噬菌体展示技术（phage display）是由George P. Smith于1985年开发的一种体外筛选抗体的方法。通过将外源编码多肽或蛋白质的基因插入到噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，使外源多肽或蛋白在噬菌体的衣壳蛋白上形成融合蛋白，随子代噬菌体的重新组装呈现在噬菌体表面，可以保持相对的空间结构和生物活性。再利用噬菌体库筛选对目标抗原有结合的抗体进行多轮的筛选，并且在大肠杆菌中扩大，该过程也被称为“淘选”。反复的筛选可逐步提高特异性识别靶分子的噬菌体比例，最终获得识别靶分子的多肽或者蛋白。

图4 噬菌体展示技术一般技术流程 

噬菌体展示技术会用到抗体库，而抗体库一旦建成，便可永久保存，不需要反复免疫和建库，允许反复筛选，且筛选后不再需要对每个抗体基因进行单独克隆，直接进行分子转化，而杂交瘤的候选克隆无法长期稳定，初筛和亚克隆的时间窗口很短，有时需要反复免疫、融合和筛选，费时费力。另外噬菌体展示技术可以针对的抗原极为广泛，但由于噬菌体无法浸染过长的序列，因而需要额外加入“组合”步骤，而组合后的单抗偶尔会出现失去亲和力或者产生自体免疫的现象。 

三、转基因鼠杂交瘤技术

1985年，Alt等人首次提出利用转基因小鼠产生全人源的抗体的概念。转基因抗体小鼠的构建需要通过转基因技术创造出缺乏原有抗体基因的小鼠胚胎，再将人源抗体基因移植入小鼠体内，迫使小鼠表达的抗体全部拥有人源序列，进而再通过传统杂交瘤创造出全人源抗体。 

此种生产方法能够通过选择杂交瘤从而出产亲和力极高的全人源单抗，比传统的嵌合抗体更具免疫多样性。但是由于增加的转基因步骤需要从胚胎阶段开始培育小鼠，且需要植入的基因序列极长，以被准确表达，其生产过程比传统杂交瘤复杂得多。 

相比于鼠源抗体，人源抗体可以更好地避免耐药性的发生。鼠源抗体仍可被免疫系统识别，并触发免疫系统介导的排斥反应，这使得在反复用药时身体会产生大量中和抗体从而减弱药效。而人源抗体由于序列与人体自身的受体更接近，在进入人体之后更难被免疫系统识别，当重复用药时药效减弱程度较鼠源CAR-T更小。 

而相较于噬菌体展示技术，转基因鼠杂交瘤技术不需要经过基因克隆、分子转换和表达重组抗体的步骤，仅需经过动物免疫、细胞培养和细胞融合、小鼠腹水制备和单抗纯化就可以完成人源抗体的初筛和功能鉴定。 

表1 基于转基因鼠杂交瘤技术开发的已上市的治疗性抗体 

总之，抗体发现是一个包括动物免疫、分子克隆、免疫学检测、功能评价等多个环节的综合技术体系。各种筛选技术中，噬菌体展示抗体库和（人源化）杂交瘤互有特点和优势，应用相对最广。我们应根据疾病的发病机制和靶点的特性综合考虑，选择合理抗体筛选技术，从而更高效地筛选出优质候选功能抗体。 

四、赛业细胞治疗服务平台 

在杂交瘤的临床前研究中，细胞模型、动物模型、建模模型的选择都至关重要，明确研究的目的，建立有效的实验模型和方案，会使研究事半功倍。赛业生物提供细胞治疗一站式服务，从抗体筛选到稳转株构建，从建立细胞/动物模型到药效学评价，更好地加速杂交瘤及其他细胞治疗研发进程。如有需要，欢迎联系我们咨询~