AAV基因治疗在眼科疾病研究中的应用及常见注射方式
一、相关背景
基因治疗是指用正常的基因导入人体细胞，以纠正或补充基因缺陷和异常所引起的疾病，是一种治疗遗传病的根本性策略。历经30年的艰难发展，基因治疗已成为治疗人类各种遗传性疾病的关键手段。腺相关病毒（AAV）因其能够感染广泛的组织且具有较低的免疫原性和较低的整合能力，被认为具有较好的安全性，因而AAV成为在体基因治疗领域最前沿、最有潜力和最常用的病毒载体之一。世界卫生组织发布的《世界视力报告》指出，在全球范围内，至少有22亿人患有视力障碍或失明，至少有10亿人是可以预防和治疗的。 眼睛由于体积小，较小剂量的AAV载体即可实现稳健转导，由于血视网膜屏障的存在，相对封闭，具备免疫赦免特性，局部给药安全性相对较高，且眼底疾病多为单基因遗传疾病，因此眼部成为基因治疗中非常热门的器官。 目前眼科基因治疗的适应症主要是与单个基因突变相关的遗传性视网膜疾病（Inherited Retinal Diseases, IRDs），包括视网膜色素变性、无脉络膜症、Leber遗传性视神经病变（LHON）、Leber先天性黑蒙（LCA）、Stargardt病、色盲症（ACHM）、X连锁视网膜劈裂症（XLRS）和年龄相关性黄斑变性（AMD）等，这些患者的独立生活和日常活动能力受到极大损害，具有极大的医疗需求。因而针对眼部的基因治疗研究一直处于基因治疗研究的前沿，是AAV基因治疗的黄金赛道，占据AAV基因治疗临床试验四分之一。 图1 导致视网膜疾病的相关基因[2] 
二、血清型选择和注射方式 目前已开展的眼科AAV基因治疗临床试验中靶向眼底的各种细胞类型有很多，如视网膜色素上皮(RPE)、神经节细胞层和感光细胞层。试验使用的载体以AAV2、5、8血清型居多，但近几年使用较多的改造载体如AAV2-7M8、AAV2-tYF、scAAV等，已被用于临床研究。 根据治疗目的不同，AAV载体介导的眼部基因转导途径主要有玻璃体腔注射、视网膜下腔注射、前房注射、结膜下注射等，其中比较常用的是玻璃体腔注射和视网膜下腔注射。在多种动物模型中，研究表明AAV载体玻璃体腔注射主要感染神经节细胞，此种注射方法会产生针对AAV衣壳蛋白的体液免疫反应，引起眼内炎症。视网膜下注射主要感染视网膜色素上皮细胞和光感受器细胞，不会触发体液免疫反应，但要注意避免注射造成的出血损伤以及潜在的视网膜脱离的风险。
三、示例展示 本文中将对眼部常用注射方法予以详细介绍，供大家在注射方法选择及操作时参考。 1.前房注射 前房是角膜和虹膜之间的腔隙，为房水所充盈。小鼠巨大的晶状体向前房隆起，小鼠的前房相对比人体的要浅得多。小鼠前房注射液体或气体可以提高眼内压，是制作青光眼模型的方法之一。具体操作步骤如下： ▶ 实验前准备 麻醉小鼠：在小鼠称重后，经腹腔注射适量的1%戊巴比妥钠溶液，放置于饲养笼内，等待麻醉约5-10min。小鼠麻倒后，眼球表面滴入扩瞳剂使其散瞳。 ▶ 前房注射 用微量注射器吸取适量病毒备用，取麻醉后的小鼠置于操作台上，眼部给予盐酸利多卡因进行局部麻醉，左手按住头部，使其眼球部分突出，右手持微量注射器从虹膜上1-2mm处插入前房，针尖平行进入，随后快速推注病毒，形成空气，使气泡正好在针头上，堵住针口，防止漏液。病毒注射完毕，缓慢抽出针头。 ▶ 动物复苏 将小鼠放回饲养笼内，注意保温，待其苏醒。 2.玻璃体腔注射 ▶ 实验前准备 麻醉小鼠：在小鼠称重后，经腹腔注射适量的1%戊巴比妥钠溶液，放置于饲养笼内，等待麻醉约5-10min。小鼠麻倒后，眼球表面滴入扩瞳剂使其散瞳。 ▶ 玻璃体腔注射 用微量注射器吸取适量病毒备用，取麻醉后的小鼠置于操作台上，眼部给予盐酸利多卡因进行局部麻醉，左手按住头部，使其眼球部分突出，右手持微量注射器自角膜后缘1mm位置插入玻璃体腔内，针尖先垂直进入，随后倾斜，慢慢推注病毒。病毒注射完毕，缓慢抽出针头。 ▶ 动物复苏 将小鼠放回饲养笼内，注意保温，待其苏醒。 图3 玻璃体注射 3.视网膜下注射 小鼠的后半眼球壁由内向外分为视网膜、脉络膜和巩膜。小鼠视网膜结构与人体类似（图4），注射具体操作步骤如下： 图4 C57BL小鼠视网膜组织HE染色图（400×） ▶ 实验前准备 麻醉小鼠：在小鼠称重后，经腹腔注射适量的1%戊巴比妥钠溶液，放置于饲养笼内，等待麻醉约5-10min。小鼠麻倒后，眼球表面滴入扩瞳剂使其散瞳。 ▶ 病毒注射 用微量注射器吸取适量病毒备用，取麻醉后的小鼠置于操作台上，眼部给予盐酸利多卡因进行局部麻醉，左手按住头部，使其眼球部分突出，右手持微量注射器自角膜后缘1mm位置插入玻璃体腔，针尖先垂直进入，随后倾斜，直至对侧视网膜（经玻璃体腔注射），有阻力时停止进针，慢慢推注病毒。或者用注射器针头与眼轴呈15°角在动物暴露出的距角膜缘1-2mm处巩膜开一个扎破巩膜但不穿透RPE的通道，针头斜面没入即停止进针（经巩膜注射），慢慢推注病毒。病毒注射完毕，缓慢抽出针头。 ▶ 动物复苏 将小鼠放回饲养笼内，注意保温，待其苏醒。 4.结膜下注射 结膜下注射是眼局部给药的常用方法。具体操作步骤如下 ▶ 实验前准备 麻醉小鼠，等待约5-10min，滴入扩瞳剂。 ▶ 病毒注射 用微量注射器吸取适量病毒备用，取麻醉后的小鼠置于操作台上，眼部给予盐酸利多卡因进行局部麻醉，用镊子夹起结膜，沿结膜内侧刺入3-4mm，可透过结膜观察到针头的走向，慢慢注射病毒，注射完毕，停留数秒拔针，注射后可见球结膜下有隆起，眼球突出。 ▶ 动物复苏 将小鼠放回饲养笼内，注意保温，待其苏醒。 图6 结膜下注射 
参考文献： [1]She, K., Su, J., Wang, Q., Liu, Y., Zhong, X., Jin, X., ... & Wei, Y. (2022). Delivery of nVEGFi using AAV8 for the treatment of neovascular age-related macular degeneration. Molecular Therapy-Methods & Clinical Development, 24, 210-221. [2]Buck, T. M., & Wijnholds, J. (2020). Recombinant adeno-associated viral vectors (rAAV)-vector elements in ocular gene therapy clinical trials and transgene expression and bioactivity assays. International journal of molecular sciences, 21(12), 4197. [3]Telias, M., Denlinger, B., Helft, Z., Thornton, C., Beckwith-Cohen, B., & Kramer, R. H. (2019). Retinoic acid induces hyperactivity, and blocking its receptor unmasks light responses and augments vision in retinal degeneration. Neuron, 102(3), 574-586. [4]Lee, S. H., Kim, Y. S., Nah, S. K., Kim, H. J., Park, H. Y., Yang, J. Y., ... & Park, T. K. (2018). Transduction patterns of adeno-associated viral vectors in a laser-induced choroidal neovascularization mouse model. Molecular Therapy-Methods & Clinical Development, 9, 90-98.
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