摘要：由环境危险因素（ERFs）引起的深层软骨细胞坏死是大骨节病（KBD）的主要病因。对 ERF 进行了多项流行病学、细胞和动物模型研究。逐渐形成了以黄腐酸(FA)为代表的水体有机物中毒假说、以硒(Se)缺乏为代表的生物地球化学假说、以T-2毒素中毒为代表的食物霉菌毒素中毒假说和复合病因学假说4种病原学假说。已根据先前的病因学假设复制了 KBD动物模型。对不同种属的动物（猴、大鼠、狗、猪、鸡和兔）进行不同的ERFs干预，观察关节软骨的临床表现和病理变化。实验组动物饲喂当地水、当地粮食、低营养、硫酸铊、FA、Se、T-2毒素和碘。硫酸铊的剂量为1154 μg/d； FA的剂量范围为5、50、150、200和211 mg/kg； Se的剂量范围为0.00035、0.00175、0.005、0.02、0.031、0.1、0.15、0.314、0.5、10mg/kg； T-2毒素的剂量范围为40、100、200、600、1000、1500、3000、6000和9000 ng/g； 碘的剂量范围为0.04、0.18和0.4-0.5 μg/g。样本量从 9 到 230 不等，具体取决于干预措施和分组。随访时间为1周至18个月。 此外，还总结了不同KBD动物模型的方法为研究KBD的发病机制提供了有益的依据。总之，饲喂地方性水和谷物的恒河猴是复制KBD的易感动物。 用T-2毒素联合硒/营养缺乏治疗的大鼠可能是一种合适且广泛使用的动物模型。

关键词：大骨节病  动物模型 软骨损伤 环境危险因素

大骨节病（KBD）是一种地方性、慢性和退行性骨关节病，患者主要为青少年和儿童。它通常表现为骨骺、骺板和关节软骨的深度坏死，伴有骨骺过早闭合和骨肿胀变形。轻度大骨节病患者出现关节疼痛、增厚、变形和活动受限，重度大骨节病患者出现手指短、畸形并最终失去工作能力。它具有较高的发病率和致残率，给大骨节病患者及其家属带来了很大的负担。完全治愈这种退行性骨关节病是困难的，减少功能障碍和缓解与 KBD 相关的膝关节疼痛至关重要。KBD 和骨关节炎在软骨基质降解方面有相似之处，尽管它们病因不同。KBD的治疗策略来源于骨关节炎的治疗经验。 常对患有肢体功能障碍和关节疼痛的成人大骨节病患者进行非药物治疗和药物治疗，最终根据病情严重程度确定是否进行手术治疗。世界各地的学者对大骨节病的病因和发病机制进行了长期研究，提出了50多个病因学假说，包括放射性中毒、维生素缺乏、内分泌失调、慢性铁摄入过多、钙缺乏、真菌中毒、黄腐酸中毒、自由基机制，硒缺乏和病毒感染。由于与大骨节病相关的环境危险因素（ERFs）及其发病机制尚不明确，尚无有效的预防措施，新发大骨节病病例难以完全控制。根据病因学假设复制了大骨节病的动物模型，并用ERFs对不同种类的动物（猴、大鼠、狗、猪、鸡和兔）进行干预，然后观察动物软骨的病理变化。通过搜索数据库识别了不同的大骨节病动物模型，这些模型分为猴、大鼠、狗、猪、鸡和兔模型。本研究旨在描述研究历史、模型方法，并比较不同的动物模型，为KBD的病因和发病机制提供新的见解。

图 1 、暴露于 T-2 毒素、硒、黄腐酸、地方性水和谷物的动物模型研究历史。

猴KBD模型：将 12 只 7-12 月龄（体重 1.5-2 kg）的未成熟猕猴随机分为 4 组。：第1组接受非地方性谷物和水。 第 2 组接受地方性水、第 3 组接受地方性谷物和第 4 组接受地方性水和谷物。对猴称重进行X线检查，并采集血液和尿液样本。在7、14和17个月时，在每个时间点每组处死一只猴，取其四肢进行苏木精和伊红（H＆E）染色和病理改变。结果显示， 2、3、4组在7个月时未观察到明显的形态学变化。 然而，软骨坏死发生在 14 和 17 个月。 轻度病例在关节软骨中观察到单个深层软骨细胞的小坏死灶。在严重病例软骨的凝固性坏死不仅表现在深层，而且扩展到中层。软骨坏死和坏死后的继发反应与人类大骨节病相似。选取20只1月龄雄性猕猴幼仔，随机分为4组。第1组的猕猴婴儿喂养非地方性水和粮食，第2组的猕猴婴儿喂养地方性水和非地方性粮食，第3组的猕猴婴儿喂养地方性粮食和非地方性水，第4组的猕猴婴儿喂养补充硒日粮的地方性水和粮食。饲养18个月后处死所有猴取四肢肋软骨和关节软骨进行病理观察。结果表明，地方水和粮食饲养的猴关节软骨基质损伤明显，特别是在第2组。除一般退行性改变外，第2、3、4组猴的软骨组织在关节软骨和骺板软骨深层均出现大面积局灶性和带状坏死。猴模型显示关节软骨硫代谢紊乱和深部软骨细胞坏死与人类大骨节病相似，表明恒河猴是复制大骨节病病理模型的易感动物。给幼恒河猴喂食地方性水和食物17个月，然后在处死前给予硫酸铊水溶液1周，并采集肢体进行光学显微镜检查，实验组每日给予1154 μg硫酸铊。结果表明，饮用硫酸铊水溶液的猴在骺板肥大层出现带状软骨细胞坏死，坏死处于早期，干骺端原始小梁大多较短且不规则。

大鼠KBD模型：

T-2毒素干预：80 只 24 日龄（体重 50-70 g）的 Wistar 大鼠随机分为 T-2 毒素组和对照组。对照组饲喂标准饲料，T-2毒素组饲喂含T-2毒素（100 ng/g）的标准饲料。所有大鼠随机喂食食物和水10个月，然后处死。最后，收集股骨和胫骨进行关节切片，H＆E和Van Gieson染色。结果显示， T-2毒素组6个月后出现股骨胫骨大面积坏死。治疗10个月后，T-2毒素组关节软骨表面损伤明显，股骨髁负荷区软骨缺损较大。Van Gieson染色显示进行性胶原纤维断裂伴蛋白多糖丢失，这是骨关节炎的早期病理损害。大鼠模型成功证明暴露于 T-2 毒素的大鼠关节软骨发生退化，与自发性骨关节炎相似，为真菌毒素在 KBD 中的病因学作用提供了支持。

T-2 毒素、低营养和日粮干预：九十只Wistar大鼠（体重，60-70 g）被随机分为三组。A组喂正常饲料，B组喂正常饲料和T-2毒素，C组喂低营养饲料和T-2毒素。低营养日粮的蛋白质、脂质、多种维生素和硒含量低于正常日粮，而T-2 毒素每周 5 天通过管饲法以 1mg/kg wd 的剂量喂食。最后收集左膝股骨远端和胫骨近端。结果表明在喂养2周后B组和C组大鼠骺板出现软骨细胞坏死。4周后软骨细胞坏死更明显。T-2毒素结合低营养日粮可导致骺板软骨细胞严重坏死，并干扰骺板小梁骨的形成。78只断奶Wistar大鼠随机分为三组。A组给予标准饲料，B组给予T-2毒素和标准饲料，C组给予影响大骨节病日粮，D组给予影响大骨节病日粮+ T-2毒素。T-2毒素以0.04 mg/kg/d或0.1 mg/kg/d的剂量灌胃，1周内给予5天以上。在第一周、第二周和第四周收集邻近骨骺的膝关节软骨和骨组织。结果显示B组第2周可见肥大层软骨细胞坏死，第4周可见板层软骨细胞坏死。C组第2周肥大层可见局灶性软骨细胞坏死。D组早期以软骨细胞局灶性坏死为主。综上所述， 影响KBD日粮或T-2毒素治疗的大鼠骺板可见局灶性坏死和板层坏死。

犬KBD模型：地方性水和粮食干预：12只幼龄犬被随机分为三组，1组饲喂地方性玉米和水，第2组饲喂地方性玉米和水加30%地方性麦麸，对照组喂非地方性玉米和水8个月。结果显示，第1组幼犬的体长和体重略低于对照组幼犬。此外，实验组出现软骨坏死、基质变性和干骺端骨紊乱。这种软骨细胞坏死与人类 KBD 一致。随后，他们发现软骨细胞的代偿性增强功能和高度致密的坏死变化。被认为是坏死表现的高度致密的软骨细胞类似于患有KBD的患者软骨中的致密软骨细胞。KBD的幼犬模型被成功复制。 由于最近报道的类似实验研究很少，因此应进行更多研究以观察超微结构和病理学的变化。

猪KBD模型：硒缺乏和T-2毒素干预：将20头小型猪（体重3.3~6.9 kg）随机分为4组，包括对照组、低硒组、低硒+T-2毒素组、低硒+T-2毒素+亚硒酸钠组。喂食1.5 mg/kg T-2毒素67天。 从第 68 天到第 103 天，T-2 毒素的浓度分别增加到3.0、6.0 和 9.0mg/kg。各组动物饲养103天后处死。结果表明，低硒喂养与软骨氨基多糖代谢之间没有显著关系。但T-2毒素对小型猪软骨氨基聚糖代谢有明显的毒性损伤与人KBD变化相似。同时，在低硒（35 ng/kg）的饲料条件下，喂食小型猪T-2毒素和亚硒酸钠（200 ng/kg），观察其前后肢软骨的病理变化。结果表明经T-2毒素处理的中国小型猪关节软骨的深层损伤与在人类大骨节病中观察到的相似。MON对小型猪的软骨组织有很强的毒性作用，并能诱发小型猪的带状或层状坏死，这与在人KBD中观察到的相似。在缺硒条件下，经T-2毒素处理的中国小型猪关节软骨的深层坏死与在人类大骨节病中观察到的相似。

硒缺乏、T-2毒素和MON干预：将32头2~3月龄健康小型猪随机分为7组，包括常规日粮、低硒日粮、低硒日粮+ 亚硒酸钠、低硒日粮+T-2毒素、低硒日粮+T- 2毒素+ Se，低硒日粮+ MON，低硒日粮+ MON+ Se组。然后处死动物，观察前肢和后肢软骨的病理变化。结果表明小型猪的病理损伤与人KBD的关节软骨相似但未观察到骨骺板软骨带状和斑片状坏死。补充亚硒酸钠的T-2毒素不能预防这种病变的发生，但可以减轻其严重程度。T-2毒素和MON均能诱发中国小型猪关节软骨深层损伤与人KBD相似，补硒可在一定程度上减轻损伤。

鸡KBD模型：硒缺乏：将雌性肉鸡随机分为三个日粮组，包括低硒（0.02 mg/kg），硒充足（0.15 mg/kg）和高硒组（0.50 mg/kg）。鸡从第一周开始服用TDP-1，一种真菌的有毒成分直到24-30 天被处死。结果表明，TDP-1和富硒组的死亡率明显低于其他TDP-1治疗组。然而，各组之间的病变发生率、严重程度和特征没有显著差异。因此，Se和TDP-1之间的相互作用对镰刀菌诱导的胫骨软骨发育不良没有影响。Se 饮食不影响由镰刀菌引起的胫骨软骨发育不全，因此该实验条件作为 KBD 模型的有效性值得怀疑。

T-2 毒素干预：将 30 只 AA 雏鸡分为三组分别口服 0、100 和 600μg/kg的 T-2 毒素。5周后处死小鸡，观察关节软骨的早期变化。结果表明，T-2毒素组软骨细胞增殖层增生挤压，细胞变形变小，细胞柱紊乱。在增殖层和过渡层之间观察到大面积的软骨细胞坏死。暴露于T-2毒素的雏鸡关节软骨发生关节炎样变化。

兔KBD模型：硒和维生素E缺乏：24只新西兰大白兔分为三组，第一组补充0.5 mg/kg亚硒酸钠和150 IUα-生育酚/kg日粮，第二组饲喂无任何补充剂的基础日粮，第三组饲喂富硒和适量维生素E日粮。饲养12周后，处死所有动物，用H&E染色对骨组织进行染色。结果显示在第二组的骨骼中观察到不同位置的新骨再生。第三组骨组织中观察到基质吸收和新骨再生。此外，在第二组和第三组中观察到大量新的未钙化骨基质，表明组织病理学结果与骨软骨病一致。同时，硒和维生素E缺乏饮食和硒过量饮食均显著降低了骨骼的生物力学强度。实验组观察到骨组织病理学改变与骨软骨病，而非KBD观察到的结果一致。

讨论：170多年来，KBD的病因具有一定的复杂性，全世界的学者陆续提出了50多个针对KBD的假想。我们总结了 KBD 不同动物模型（猴、小鼠、狗、猪、鸡和兔）的优缺点。用地方性水和谷物处理的恒河猴模型可以显著干扰硫代谢，降低软骨CH∙S和糖胺聚糖。此外，血清中乳酸脱氢酶、天冬氨酸转氨酶、丙氨酸转氨酶、碱性磷酸酶和肌酸磷酸激酶的水平升高，与人类 KBD 中观察到的相似。关节软骨和骺板软骨的软骨细胞表现出与大骨节病相似的病理生理学变化。结果表明，恒河猴是复制大骨节病病理模型的易感动物。给予T-2毒素和低硒饮食/营养的大鼠，外周血和关节软骨中IL-1β、TNF-α和IL-6的表达水平显著升高，外周血中T-AOC、CAT、SOD和GPX的抗氧化水平显著降低。软骨组织中II型胶原和TIMP-1水平降低，而MMP-1、MMP-3和MMP-13水平显著升高，caspase-3、p53和Bax的蛋白和mRNA水平升高。结果表明接受T-2毒素和低硒饮食/营养的大鼠，细胞外基质降解和抗氧化活性降低，这促进了关节软骨的软骨细胞凋亡，导致软骨细胞坏死、关节软骨退变和骺板异常，这与在大骨节病中观察到的相似。因此，T-2毒素和低硒/营养暴露的大鼠是一种合适且广泛使用的大骨节病动物模型。

T-2毒素和低硒饲料饲养的小型猪通过抑制蛋白多糖的合成，表现出关节软骨的基质代谢紊乱，导致小型猪关节软骨的深带状或片状坏死类似于人类大骨节病。小型猪是研究大骨节病的合适实验动物。然而与人类相比猪的半月板更宽，十字韧带更长，骨骼在10-24个月时成熟。鸡模型表明，硒缺乏引起的鸡胫骨软骨发育不全的病理特征与人类大骨节病相似。鸡模型的表达和临床过程与在大骨节病中观察到的显著不同，并且将该实验条件用作大骨节病模型值得怀疑，因为硒饮食不会影响镰刀菌诱导的胫骨软骨发育不全。硒干预实验的组织病理学结果与骨软化症一致但未观察到大骨节病样变化。兔的步态与人类不同，其软骨比人类薄10倍。虽然用地方性水和谷物诱导的狗模型已成功复制，但由于最近很少报道类似的实验研究，需要进一步研究来观察超微结构和病理变化。

结论：大鼠给予T-2毒素联合硒/营养缺乏可能是目前一种适用且广泛使用的模型，而饲喂地方性水和谷物的恒河猴和狗是复制KBD的易感动物。在缺硒条件下用T-2毒素饲喂的猪成功地复制了KBD动物模型。 而鸡和兔未能复制 KBD 模型。

原文出自：Animal models of Kashin-Beck disease exposed to environmental risk factors: Methods and comparisons - ScienceDirect