目的 本研究拟构建肌肉特异表达Cas9示踪同源打靶载体，为成肌细胞分化研究及肌肉特异表达Cas9小鼠模型制作奠定基础。

方法 人工合成肌肉特异启动子SP，替换PX459载体中的CMV启动子，构建肌肉特异表达Cas9载体；载体在C2C12细胞中的编辑效率由X6al和T7E1酶切检测；在此基础上通过同源重组引入DsRed红色荧光蛋白构建Cas9示踪载体；将示踪载体的SP-Cas9-DsRed部分连接至Rosa26位点左右同源臂之间，构建肌肉特异表达Cas9示踪重组载体将该载体与PX459-Rosa26共转染至C2C12细胞并进行嘌呤霉素筛选，观察荧光的表达，同时，提取细胞DNA进行PCR鉴定和测序，检测载体在C2C12细胞中的整合情况。

结果 酶切鉴定以及对目的片段的测序结果表明，成功构建了肌肉特异表达Cas9载体PX459-Rosa26-SP和肌肉特异同源打靶示踪载体Donor-Cas9-SP-DsRed；Xbal和T7E1酶切实验表明，PX459-Rosa26-SP在C2C12细胞中具有较高的编辑效率；转染后的C2C12细胞出现红色荧光，表明Donor-Cas9-SP-DsRed具有表达活性且在肌肉细胞中特异表达；PCR 鉴定和测序结果表明，Donor-Cas9-DsRed在C2C12细胞Rosa26位点成功整合。

结论 成功构建了肌肉特异表达Cas9示踪同源打靶载体Donor-Cas9-SP-DsRed，在为肌肉特异表达Cas9小鼠模型制备提供载体基础的同时，也为肌肉相关基因疾病的研究与基因治疗提供了新的思路。

阅读原文：肌肉特异性表达Cas9示踪同源打靶载体的构建及其在C2C12细胞中的整合.pdf