1.PRNP基因敲除模型  建立目标基因的转基因小鼠是研究基因功能的基本策略，自美国科学家Prusiner于1982年提出“朊病毒”假说以来，科学家们进行了大量的实验去证明体内存在于神经元细胞的正常膜蛋白(PrPC)作为底物直接参与了朊病毒的复制，PRNP基因敲除小鼠模型的建立更加直观的明确了PrPC在朊病毒病的发生、发展中的重要作用，也为研究PrPC在机体内的正常生理功能提供了更为可靠的实验模型。鼠的PRNP基因定位于第2号染色体短臂上，是一个由三个外显子组成的单拷贝基因，但完整的开放阅读框都包含在第三个外显子中。研究者们先后建立了各种PRNP基因敲除小鼠，虽然敲除基因所运用的同源重组的策略不同，但是所有突变小鼠都缺乏PRNP开放阅读框的重要区域且 PrPC的表达被终止。保守性策略主要是在PRNP基因的开放阅读框中插入或者删除一定的序列(包括Prnp 0/0[ZürichⅠ]或者Prnp -/-[Edinburgh])，这两种形式的纯合子小鼠均发育正常，没有明显的病理改变，但抵抗朊病毒感染。另外更加彻底的策略是在完全删除阅读开放阅读框的同时，删除编码区两侧翼的基因序列，特别是第三外显子的剪辑受体(包括Prnp -/-[Nagasaki]，Rcm0，Prnp -/-[ZürichⅡ])。这种形式的纯合子小鼠虽然发育正常，但是由于小脑浦肯野细胞的异常，出现与年龄呈正相关的共济失调。 

2.PRNP基因敲除小鼠表型  Prnp 0/0(ZürichⅠ)或者Prnp -/-(Edinburgh)小鼠发育和繁殖能力都非常正常。进入老年期，小鼠表现外周神经系统髓鞘脱失但并不伴随明显临床症状。行为学研究显示除了睡眠节律与昼夜活动有所改变，其他与野生型小鼠无明显不同。电生理检测显示GABA-A受体介导的快速抑制作用被减弱，长时间协同作用受损，某些细胞钙激活钾通道被中断。同时ZürichⅠ型的基因敲除小鼠还存在清除自由基酶系统活性降低的生化改变。

相反，Prnp -/-[Nagasaki]，Rcm0和Prnp -/-[ZürichⅡ]这几种完全敲除PrP第三外显子以及外显子两侧侧翼序列的小鼠在老年期表现出严重的共济失调和浦肯野细胞的丢失，而这种表型在转入外源的PrP后可以得到完全的逆转。有人认为PrPC的缺失导致了以上表型的出现，但在Prnp 0/0(ZürichⅠ)和Prnp -/-(Edinburgh)小鼠中并没有类似症状的出现，因此也有人认为这些异常表型的出现更有可能是缺失PrP开放阅读框两侧的序列所致。最终在出现共济失调的三种PRNP敲除小鼠脑中发现高表达Doppel(Dpl)蛋白，这一蛋白的高表达解释了PRNP基因敲除后出现的异常神经系统病理改变。

Doppel是由Prnd基因编码的179氨基酸的蛋白，位于Pmp基因下游16kb处。这种具有磷脂酰肌醇锚的N-糖基化蛋白可在小鼠多种组织内表达，包括睾丸组织和心脏，而在脾和骨骼肌中低表达，但是在成年小鼠脑中并不表达。Doppel蛋白的一级结构与PrPC端的2/3有25％的同源性，但其分子量小，缺少PrPC N端八肽重复序列区和一小段高度疏水区，目前对Doppel的生理功能并不清楚，除了雄性Prnd 0/0小鼠不育外，敲除Doppel基因小鼠未见其他生理缺陷。

研究发现发生共济失调的转基因小鼠(Prnp -/-[Nagasaki]，Rcm0和Prnp -/-[ZürichⅡ])出现Doppel高表达，而另两种表型相对正常的小鼠(Prnp 0/0[ZürichⅠ]，Prnp -/-[Edinburgh])却未发现类似现象(表13-2)。

野生型小鼠在颅内接种小鼠敏感的羊瘙痒毒株后，通常在160d左右出现临床症状，10 d后死亡。而接种相同的羊瘙痒毒株，Prnp 0/0小鼠在接种后2年不出现任何临床症状，尸体解剖表明，接毒57周后Prnp 0/0小鼠神经组织仍然没有任何羊瘙痒病相关病理改变。除此之外，羊瘙痒因子在野生型小鼠接种20周后分别在大脑和脾复制增长8.6和6.9 log LD50 units/ml，而在Prnp 0/0小鼠,体内没有任何复制。这些证据显示PrPC是朊病毒病发生、发展的必要因素。少数情况下，Prnp 0/0小鼠颅内接种后可在其脑组织内检测到低水平感染性，这可能是接种物残留或实验过程污染造成的。

介于野生型和纯合子PRNP基因敲除小鼠之间，仅敲除PRNP一条等位基因的杂合子小鼠颅内接种羊瘙痒因子后，感染的潜伏期延长至400～460天。这种杂合子小鼠在感染后20周左右脑内沉积的异常蛋白PrPSc的效价与野生型小鼠相似，具有高度的感染性，但这一隐性感染将持续存在，最终在感染50周后才表现明显的临床症状。这一现象说明PrPc蛋白表达量的多少对疾病潜伏期有明显的影响但并不会因此改变疾病最终产生的病理特征。

3.表达突变型PrP小鼠模型  利用反向遗传学将修饰过的PRNP基因转入Prnp 0/0小鼠而建立的表达突变型PrP小鼠模型在研究朊病毒病中解决了以下的问题。

(1)确定PrPC序列中参与转化和复制的关键区域：对PRNP基因敲除小鼠模型的研究证实PrPC是朊病毒病发生发展的必要因素，致病性PrPSc必须以PrPC为底物，与PrPC结合后引起构象转化形成新的PrPSc分子。感染因子PrPSc不能被蛋白酶完全消化但可被切除N端60个氨基酸，剩下的蛋白酶抵抗部分仍然具有感染性。为了进一步分析和明确PrPC序列中参与转化和复制的关键区域，研究者们利用基因工程技术，产生各种缺失突变体，以明确这些区域在PrPC向PrPSc转化中可能的作用。向Prnp 0/0[ZürichⅠ]小鼠体内导入全长和不同程度氨基端缺损的PRNP基因，产生了高表达全长PrPC的Tga20小鼠系，表达氨基端缺损PrP(A32-80)的D11/D12小鼠系，表达PrP(A32-93)的C4/C15小鼠系，表达PrP(A32-106)的D32小鼠系，表达PrP(A32-121)的E11小鼠系以及表PrP(A32-134)的 F35小鼠系。与野生小鼠相比，Tga20小鼠系可10倍高表达全长PrPC蛋白，其感染羊瘙痒因子小鼠敏感株RML潜伏期从原来的160天提前为62天左右，D11/D12小鼠系和C4/C15小鼠系颅内接种羊瘙痒因子最终也导致疾病发生，但潜伏期均延长，其中C4/C15小鼠系潜伏期更长，组织内沉积异常PrPSc水平和感染性也均降低。当缺损扩大到106位氨基酸， D32，E11，F35小鼠系对瘙痒因子均不敏感。

这些转基因小鼠证实至少PrP氨基端的60个氨基酸在PrPSc转化和复制中并不是必须的，但这部分的缺失会延缓疾病的发生。除此之外，Tg4290小鼠系是构建的一株高效表达缺失23～88位氨基酸和第一个α螺旋结构域(141-174)PrPC的转基因小鼠。这株小鼠也能成功的感染羊瘙痒因子，但潜伏期较长大约300天，这说明第一个仅螺旋结构域在PrPSc转化和复制中有一定的作用，但也不是关键性区域。

(2)研究PrPC生理功能以及明确PrPC各个结构域与这些生理功能之间的关系：不同于野生小鼠，高表达各种突变PrPC的小鼠系在生长发育过程中自身可能会出现不同程度的病理表型。表达PrP(△32-93)和PrP(△32-106)的转基因小鼠表型正常，表达PrP(△32-121)和PrP(△32-134)转基因小鼠在出生后1～3个月出现严重的共济失调，大脑皮质颗粒细胞大量凋亡，有学者怀疑这种缺损PrP蛋白具有某种神经毒性，但这一假设不能解释缺损PrP蛋白对脑内其他类型的神经元细胞没有类似的影响。向这两株小鼠导入一个野生型的Prnp等位基因，虽然表达缺损PrP蛋白水平没有改变，但小鼠出现的病理表型完全得到纠正，提示缺损氨基端的PrP蛋白可能作为抑制剂与野生型PrPC竞争潜在的结合底物。Flechsig等用L7启动子，在Prnp 0/0[Zürich Ⅰ]小鼠浦肯野细胞特异性表达这种缺损 PrPC，小鼠出现共济失调、浦肯野细胞退行性改变，但这种小鼠大脑皮层颗粒细胞并不受影响。Doppel蛋白无论在一级结构还是空间结构上与缺乏弹性易弯曲N端的PrPC有高度的相似性，因此与表达PrP(△32-121)和PrP(△32-134)转基因小鼠相似，严重的共济失调和大脑皮质颗粒细胞凋亡也在高表达Doppel的Prnp -/-[Nagasaki]小鼠中出现，并且转入野生型PRNP基因后这些病理表型消失。表达PrP(△32-134)转基因小鼠与表达PrP(△32-93)转基因小鼠杂交得到的后代病理表型不再出现，与PrP(△32-106)转基因小鼠杂交后代虽然病理表型依然出现，但潜伏期明显延长，提示93-134位氨基酸参与PrPC发挥正常的生理功能。表达缺失八肽重复区(△23-88)，或合并缺失第一个α螺旋和第二个β折叠(△141-176)PrP的小鼠没有异常表型，但表达缺失第二个α螺旋(△177-202)或第三个α螺旋(△201-217)PrP的小鼠严重影响PrPC的正确折叠，出现类似于神经元蓄积症的表型，最终导致小鼠死亡。

在培养细胞中，成熟的PrPC被逆行转运到细胞质，随后被细胞内蛋白酶消化。即使细胞质中聚集少量的PrPC蛋白，也会对细胞造成强烈的神经毒性。给Prnp 0/0小鼠导入不带信号肽序列的鼠源PRNP基因，导致大量的细胞质PrPC聚集，小鼠出现严重的共济失调伴随大脑皮层的退行性改变和胶质化。PrPC向PrPSc转换的同时伴随由α-螺旋结构为主向β-片层结构为主的构象变化，Scott等将PrP蛋白113、115和118位丙氨酸突变为缬氨酸，这三个位点的突变，导致PrP蛋白弹性易弯曲尾端自发性β折叠，这种转基因小鼠发生致死性神经系统疾病，但是这种病症不可传播，在神经系统也未检出抵抗蛋白酶消化的PrPSc。

(3)阐明种属屏障的分子基础：朊病毒病在不同物种间传播存在种属屏障，种属屏障的基础较复杂，但目前认为与动物的PrP蛋白基因型有关，与PRNP基因DNA排列顺序有关。DNA排列顺序越相似，动物间传染的种属屏障就越小。研究发现宿主PrP单个或多个位点突变可以提高对其他物种来源感染因子的易感性，并缩短疾病的潜伏时间。人与鼠PrPC有25个氨基酸位点变异，其中有9个位于96～167区域。用人PrP96-167氨基酸序列取代小鼠序列，在小鼠体内表达嵌合型PrP(Hu/Mo PrP)蛋白，这种转基因小鼠对人CJD易感，接种后200d内所有实验动物出现明显神经病理改变。此外将小鼠PrPC蛋白108与111位氨基酸用人氨基酸取代后(L108M，V111M)，转基因小鼠对小鼠易感性朊病毒毒株 RML不再敏感。通过NMR技术对体外构建的多种属来源PrPC蛋白分析发现这些PrPC在结构上各有不同，DNA排列顺序决定了蛋白质的一级结构，而一些特殊的氨基酸的存在又决定了蛋白质不同的二级空间结构，不同物种来源的PrP蛋白在这些特殊氨基酸上的不同，可能是导致种属屏障的原因之一。

(4)研究人类家族遗传性海绵样脑病：在人类的朊病毒疾病中，有10％～15％是与 PRNP基因的点突变、插入或缺失突变有关。到目前为止，发现与人类遗传性朊病毒病[包括致死性家族型失眠症(fatal familial insomnia, FFI)和GSS综合征]相关的有20个氨基酸点突变和不同长度的八肽重复插入。一些学者推测这些点突变的存在可能导致PrPC蛋白结构不稳定，发生自发性的结构改变，转化为PrPSc蛋白。但体外对这些位点突变的PrP蛋白C末端热力稳定性的研究并不支持这种推测，突变PrP蛋白并不改变其结构稳定性。

人类家族遗传性朊病毒病小鼠模型的建立将在生物化学、生理学、行为学以及神经病理学等方面对这类疾病进行系统的研究，从而揭示更多未知的发病机制以及实验性探索可能的治疗手段。研究者多次尝试将各种位点突变的PRNP基因导入小鼠体内，其中大部分位点突变不导致小鼠出现海绵样脑病。例如，Prnp 0/0小鼠表达与遗传性CJD有关的突变PrP(T183A)和PrP(E199K)均未出现任何病理改变。但将与家族性GSS遗传性有关的PrP(P102L)引入Prnp 0/0小鼠后，8倍表达突变基因产物的Tg(MoPrPP101L)H小鼠，在出生后140d自发的出现中枢神经系统的神经变性，虽然脑组织中几乎不能检测到PrPSc，但有行为异常的小鼠具有典型的PrP淀粉样斑块和海绵状脑病改变。将这种发病小鼠脑组织颅内接种野生型小鼠不能引起感染，但接种低度表达(2倍)突变基因产物的Tg(MoPrPP101L)L小鼠将导致小鼠在生命后期出现特征性脑病，这一结果也说明单一的氨基酸序列差异也可引起感染屏障的发生。Prnp 0/0小鼠表达PrP(A116V)也出现类似于GSS综合征的病理改变。此外，Prnp 0/0鼠转入具有9个额外八肽重复序列插入的PRNP基因后，缓慢出现进行性小脑异常和肌肉病变。Prnp 0/0小鼠表达113、115和118位丙氨酸突变的PrP蛋白发生致死性神经系统疾病。这三个位点的突变，导致PrP蛋白弹性易弯曲尾端自发性形成β折叠，以上两种转基因小鼠虽然最终出现一定的神经系统病理改变，但是病症不可传播，在神经系统也不能检出抵抗蛋白酶消化的PrPSc。最近的一项研究报道将与FFI有关的 D177N基因突变PrP转入Prnp 0/0小鼠后，小鼠自发出现类似于人FFI的相应病理改变。与GSS小鼠模型不同，FFI小鼠模型脑组织具有一定程度的传染，这可能与这两种疾病本身的发病时间有关，在人类中，患有FFI的病人从发病到死亡仅1年时间，而GSS则有5年存活期。由于小鼠生命周期短，可能导致在观察期内GSS动物模型脑组织检测不到感染性。

(5)通过易位表达PrPC研究朊病毒复制和扩散的机制：将PRNP基因开放阅读框与组织特异性启动原件偶联转入Prnp 0/0小鼠，建立某一种组织或器官特异性表达PrP蛋白的转基因动物对解释朊病毒复制的细胞特异性和朊病毒在机体内可能的扩散方式提供了更加直观的研究平台。中枢神经系统中，PrP蛋白可在神经元细胞和星型胶质细胞内大量表达，为了明确这两种细胞在朊病毒复制中的作用，分别将仓鼠PRNP基因开放阅读框偶联神经元特异性烯醇化酶(neuro-specific enolase, NSE)启动子或胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)启动子转入Prnp 0/0小鼠，建立的神经元特异性表达PrP和星形胶质细胞特异性表达PrP的转基因小鼠均对仓鼠来源的朊病毒毒株易感，说明这两种细胞均参与了脑内朊病毒的复制。

自然感染的朊病毒病，包括疯牛病、变异性CJD、克雅病、羊瘙痒病以及鹿的慢性消耗病均是通过胃肠道途径感染引起。抵抗蛋白酶消化的特性，使得朊病毒因子在胃肠道中得以聚集，但是目前仍不清楚朊病毒是如何穿过肠道黏膜M细胞，全称膜性细胞(mem- brahe cell)，为一种特化扁平上皮细胞，位于肠道黏膜淋巴结的滤泡上皮中。在肠道Peyer淋巴结滤泡上皮中，M细胞与肠上皮细胞紧密排列在一起。研究发现M细胞是大分子颗粒抗原进入上皮下淋巴组织的主要途径。推测在摄入感染因子后，朊病毒首先通过M细胞进入Peyer淋巴结和肠道的神经系统，因此Peyer淋巴结和滤泡树突状细胞的数量一定程度上决定了口服感染的敏感性。除此之外，机体其他组织的淋巴网状系统，尤其是脾和淋巴结都是朊病毒复制和聚集的主要部位。有研究认为骨髓树突细胞参与了朊病毒向脾和淋巴结的转运。在脾内，PrPSc主要存在于滤泡树突状细胞，也可在脾分化的B细胞和T细胞中发现，但这种口服感染引起朊病毒病动物外周血淋巴细胞不具有感染性。为了明确B细胞和 T细胞在朊病毒复制和传播中的作用，构建了相应的细胞特异性表达PrP的转基因动物。利用LCK启动子，小鼠高度选择性地在脾和胸腺T细胞中表达PrP，这种转基因小鼠腹腔注射感染因子一年后，没有出现任何临床症状，脾、胸腺以及脑组织不具有感染性。同样利用CD19启动子，在B细胞中高表达PrP的转基因小鼠腹腔接种感染因子后也未出现任何病理表型。这些实验证实仅在B细胞和T细胞中表达PrP不能完成朊病毒感染因子的复制和传播，自然感染动物脾脏中的B细胞和T细胞中存在的PrPSc可能并不是因为这些细胞内发生朊病毒复制，而仅仅是对滤泡树突状细胞复制的PrPSc的转运。此外，利用α-肌动蛋白启动子构建的肌肉组织特异性表达PrP蛋白的Prnp 0/0小鼠感染朊病毒后，感染因子在肌肉组织复制和沉积。利用肝特异性甲状腺素转运蛋白启动子建立的肝脏特异性表达PrP蛋白的Prnp 0/0小鼠感染朊病毒后，低剂量的感染因子在肝脏和脑组织中检测到。不同细胞特异性表达PrP蛋白对感染因子复制和传播有着不同的影响，这提示我们除了细胞表面表达PrPC蛋白，一些特殊膜结构或伴侣蛋白也参与和影响了PrPC向PrPSc的转化。

实验发现Prnp 0/0小鼠移植正常表达PrP蛋白的脑组织后，颅内接种感染因子会在移植物中出现朊病毒病相应的病理改变，但是腹腔注射感染因子不能引起移植物的病理改变。因此说明外周组织正常表达PrP蛋白是保证朊病毒从外周系统向中枢系统传播的必要条件。对Prnp 0/0小鼠移植野生型小鼠骨髓后，腹腔注射感染因子可导致朊病毒在脾复制和沉积，但小鼠移植的脑组织内没有PrPSc的沉积和相应的病理改变。这说明朊病毒最终需要外周神经系统(迷走神经或脊髓)参与才能由脾或其他的部位进入到脑组织。事实上受NSE启动子控制的仓鼠PrP蛋白在Prnp 0/0小鼠体内可以正常地在中枢和外周神经系统表达。通过口服或腹腔注射来源于仓鼠的朊病毒毒株，这种转基因小鼠与全身表达仓鼠PrP蛋白Prnp 0/0小鼠具有相同的潜伏期和病理改变。这个实验提示颅外高剂量感染朊病毒，机体淋巴网状系统可能并不参与病毒的复制和传播。朊病毒如何在神经系统中传递目前并不清楚，从传递速度(1mm/d)来看，不属于轴突慢速运输(0.1～0.4mm/d)和快速运输(100～400 mm/d)，有学者认为施万细胞可能参与了朊病毒在神经系统的传递，但这一假设被最近的研究否定，该研究建立施万细胞特异性敲除PRNP基因的转基因小鼠，虽然这种转基因小鼠外周神经系统表达总PrPC蛋白减少90％，并且选择性丢失一些糖基化形式的PrPC，但外周接种羊瘙痒因子成功导致中枢神经系统感染因子的聚集和典型的病理改变。

(6)研究doppel在prion疾病中的作用：Nagasaki和ZürichⅡ小鼠在老年期表现出严重的共济失调和浦肯野细胞的丢失，伴随了脑组织异常高表达doppel蛋白。这两种小鼠由于敲除了连同部分Prnp第二个内含子(包括剪接受体)在内的PRNP基因，基因间的拼接显示了dpl基因受Prnp启动子控制。这种拼接方式在野生型小鼠水平极低，但是由于缺乏 Prnp第二个内含子剪接受体，于是这种拼接方式在基因敲除小鼠中被大大强化了。进一步研究发现，doppel在脑内的表达水平与小鼠发生共济失调的症状呈正相关，即增加了Prnd表达水平，会加速病情发展，这一点也说明了PRNP敲除的转基因小鼠出现的神经退行性变性病变与过度表达doppel相关，而与PrPC本身功能丧失关系不大。

Nagasaki和ZürichⅡ鼠转入Prnp后，能逆转小鼠发生类似的脑部病变，因此PrP能够拮抗doppel引起的神经毒性，PrP缺失是doppel引起神经细胞凋亡的必要条件。有趣的是，在ZurichI小鼠中高表达缺损PrP(缺失八肽重复序列和保守的106-126段，命名为△F)，这些小鼠在出生后不久即发生共济失调和小脑颗粒细胞丢失。转入完整的PrP可阻止疾病的发生。△F，即缺损的PrP片断与Doppel结构相似，同时，二者所致的神经细胞凋亡都能被PrP拮抗，因此认为Doppel和△F引起的神经细胞凋亡机制相似。

虽然doppel在PRNP基因敲除小鼠出现的神经退行性变性病变中发挥作用，但在朊蛋白疾病中的作用并不肯定。在感染朊病毒病的小鼠中枢神经系统细胞中敲除Prnd并不影响朊病毒病的潜伏期、空泡形成和PrPSc沉积等病理过程。同时，检测人朊蛋白病中Prnd突变因子联系失衡的可能性，结果发现Prnd有4种多态性，但这些多态性和人类朊蛋白疾病间也无太大的关系。这些发现进一步质疑了doppel在人类遗传性朊蛋白疾病中发挥作用。

(7)高表达其他物种来源PrP蛋白小鼠模型：由于朊病毒病存在着明显的种属屏障现象，这导致实验小鼠对其他物种来源的朊病毒毒株易感性低、潜伏期长，阻碍了对朊病毒病的研究。因此，研究者尝试给小鼠转入其他物种来源的全长或部分PRNP基因序列，转基因小鼠可以克服种属屏障大大提高对这些物种来源的朊病毒毒株易感性。Prnp 0/0小鼠转入牛PRNP基因后对牛源性朊病毒、人变异性CJD以及羊瘙痒病感染因子均易感。野生型小鼠体内转入仓鼠PRNP基因后对小鼠源和仓鼠源的朊病毒均易感，而Prnp 0/0小鼠体内转入仓鼠PRNP基因后仅对仓鼠源的朊病毒易感。令人惊奇的是，与Prnp 0/0小鼠相比， Prnp +/0小鼠体内转入仓鼠PRNP基因后降低对仓鼠源的朊病毒易感性。此外，Prnp +/+小鼠转入人PRNP基因后可感染人散发性CJD，但高表达人PrP蛋白的Prnp +/+小鼠与野生型小鼠一样对人源性朊病毒不易感，甚至对家族型CJD的易感性较野生型小鼠更低。Scott等认为同时存在不同物种来源的PrPC会竞争性结合一些伴侣蛋白(如因子X)，从而会影响转基因小鼠对感染因子的易感性，因此越来越多的表达异源种属PrPC的小鼠模型以Prnp 0/0小鼠为基础构建，以便排除小鼠自身表达的鼠源PrPC对感染实验可能的干扰作用。