1.基因工程小鼠模型制备  就朊病毒病的研究来说，目前主要包括PRNP基因敲除小鼠和表达外源PRNP基因小鼠。

(1)PRNP基因敲除小鼠：基因敲除是自20世纪80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术，是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。通常意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的。目前已有的五种PRNP基因敲除小鼠(图13-1)，均是通过建立缺失或插入突变PRNP的同源重组替换载体后，将重组载体通过一定的方式(电穿孔或显微注射)导入小鼠胚胎干细胞中，使缺失或插入突变PRNP DNA与胚胎干细胞基因组中PRNP相应部分发生同源重组，最终缺失或插入突变PRNP DNA序列整合到小鼠基因组中。下面以 Prnp -/-[ZürichⅡ]小鼠为例，简要说明PRNP基因敲除小鼠制备方法。

利用pBS-KS为骨架载体，插入包括小鼠PRNP第三个外显子及上游1.4kb，下游3.7 kb DNA序列，为了筛选方便，在外显子前同时插入两个筛选基因HSV-tk和neo。三个loxp序列分别插入在HSV-tk基因前，neo基因后，Prnp外显子后，构建PRNP lox3替换载体。

用内切酶将替换载体线性化后，用电穿孔的方法转入培养的小鼠胚胎干细胞。转化后24h用G418对细胞进行筛选，随后用PCR鉴定形成的细胞克隆，阳性克隆再用Southern blot鉴定基因组是否与替换载体发生同源重组。为了将PRNP外显子剪切，向阳性细胞克隆中转入表达Cre质粒，外源Cre的表达使得三个loxp位点中的两个位点随机剪切后连接(Prnp lox2和Prnp lox1)。将这些阳性细胞利用显微操作的方法注射入C57BL/6小鼠囊胚期胚胎的腔内，生产的F1代小鼠用PCR和Southern blot筛选出成功剪切掉所有筛选标记基因和Prnp第三个外显子基因的小鼠，Prnp -/-[ZürichⅡ]。

(2)表达外源PRNP基因小鼠：常常用显微注射法构建表达外源PRNP基因小鼠。显微注射法是指通过显微操作仪把外源基因注入受体动物的受精卵，外源基因整合到受体细胞染色体上，发育成转基因动物的技术。这种方法的优点是外源基因的导入整合效率较高，可以把不同长度的重组DNA片段注入原核，不需要载体，直接转移目的基因，它可以直接获得纯系，实验周期短。它的主要缺点是外源基因的整合位点和整合的拷贝数都无法控制，易造成宿主动物基因组的插入突变，引起相应的性状改变，重则致死。目前已成功建立了几十种表达外源PRNP基因的小鼠模型(表13-4)。

(3)常用PRNP转基因载体：目前有两种载体常用于PRNP转基因小鼠的构建，PrP cosmid和half-genomic PrP vector。40kb小鼠粘粒I/InJ来自于鼠Prnp b等位基因，包括6kb启动子，三个外显子和两个内含子，以及包括Prnd基因的3'下游18kb序列。过大的粘粒并不利于实验操作，随后又构建了来自于鼠的Prnp a等位基因，包括启动子序列，三个外显子和第一个内含子，以及3'下游2.2bp序列的half-genomic PrP vector，这个质粒不包括 Prnd基因。