一、检测靶点抗原的表达丰度

CAR-T细胞通过其scFv精准识别肿瘤细胞上的抗原并发挥杀伤作用，因此筛选理想的靶点抗原是一个重要的步骤。筛选高特异性的靶点抗原，需要检测靶点抗原在所有细胞中的表达丰度，筛选到在肿瘤细胞高表达且在正常细胞不表达或低表达的抗原，以此尽可能避免CAR-T细胞疗法的毒副作用。流式细胞术在这个过程中有重要的应用。比如下面的报道中，作者通过流式细胞术检测了靶点抗原BCMA的分布情况，发现BCMA在正常和肿瘤PC细胞上均高表达。而在正常组织中不表达或低表达。

图1 流式细胞术检测靶点抗原的表达丰度^[1]

二、病毒滴度检测

CAR-T临床研发前需要构建CAR-T细胞和抗原过表达的肿瘤细胞模型，用于后续评估CAR-T细胞的抗肿瘤能力。一般而言，通过能够编码目的序列的慢病毒来侵染对应的细胞系，可高效构建上述的稳转细胞模型。在这个过程中，慢病毒的滴度是受到严格质控的。流式细胞术是其中一种检测慢病毒活性滴度的重要手段。下面以一个实例介绍流式细胞术在慢病毒滴度检测方面的应用：

我们需要检测CD19抗原慢病毒的滴度，将能编码CD19抗原的慢病毒纯化液以0.01、0.1、1、10μl四个梯度分别加入到事先接种的293T细胞中，72小时后流式检测293T细胞CD19抗原的阳性率（即被慢病毒感染的293T细胞占细胞总数的百分比），进而按如下公式计算慢病毒的转导滴度：

A：表示0.1μl组阳性细胞占比

B：表示0.01μl组阳性细胞占比

N：加入病毒时候细胞数量

V：表示A组中病毒的加入体积

图2 CD19抗原慢病毒滴度检测结果

（数据来源：赛业生物）

如图所示，CD19抗原阳性细胞的数量随转染病毒梯度的增加而逐渐升高，表明该慢病毒有良好的感染活性，并按上述公式计算病毒滴度为：1.4×10⁸Tu/ml。

同样地，采用上述方法检测CD19 CAR慢病毒滴度，经计算后得到病毒滴度约为：4.33×10⁸Tu/ml。

图3 FMC63 CAR慢病毒滴度检测结果

（数据来源：赛业生物）

三、CAR-T细胞表型分析以及CAR阳性率（或过表达抗原细胞模型的抗原阳性率）

对于构建好的CAR-T细胞，在进行功能验证前需要检测其表型和CAR分子的阳性率。流式细胞术可有效检测CAR-T细胞表面的标志蛋白和CAR分子的阳性率。同理，对于构建的过表达抗原细胞模型，也可通过流式细胞术检测抗原表达情况。下面通过实例进行介绍。

对两种方法制备T细胞用抗体标记后表型进行分析，结果显示两种方法均能获得高纯度的T细胞，但二者扩增出来的不同亚型T细胞的占比有较大的差异，Method1扩增出来的T细胞以CD8+T细胞亚型为主，而Method2可扩增出CD8+T细胞和CD4+T细胞占比差异较小的T细胞群体，这两种方法为研究不同亚型T细胞的作用奠定了坚实的基础。同时，我们用CD19 CAR慢病毒转染Method1扩增出来的T细胞，构建CD19 CAR-T细胞，并使用流式法检测CAR蛋白的表达效率，结果显示CD19 CAR-T的阳性率可达到45.59%，表明我们成功构建了CD19 CAR-T细胞。

图4 T细胞表型分析及FMC63 CAR-T细胞阳性率检测。A.PBMC活化扩增第十天T细胞占比及表型分析实验结果。B.FMC63 CAR-T细胞CAR阳性率检测结果。（数据来源：赛业生物）

通过CD19慢病毒感染293T细胞，构建CD19稳定表达的293T细胞株，并采用流式检测其抗原CD19的高表达。

四、体外检测CD19 CAR-T细胞的杀伤效果

将CAR-T细胞与肿瘤细胞或构建的抗原过表达细胞模型混合，检测肿瘤细胞或抗原过表达细胞模型的死亡，可反映CAR-T细胞杀伤效果。其中，通过流式细胞术可检测肿瘤细胞的凋亡情况。如下面的这个实例：

将CD19 CAR-T细胞和T细胞分别以不同效靶比同Nalm6细胞共孵育48h，随后流式法检测肿瘤细胞凋亡。如图所示，与T细胞组相比，不同效靶比条件下，CD19 CAR-T细胞均展现出了对Nalm6细胞明显增强的特异性细胞毒性作用。同时细胞培养上清中细胞因子含量检测结果也显示，同肿瘤细胞共孵育后CD19 CAR-T细胞因子IFN-γ分泌量相比于T细胞具有显著的增强。

图6 CD19 CAR-T细胞杀伤Nalm6肿瘤细胞实验结果。A.Nalm6细胞表面CD19抗原阳性率检测结果；B-C.FMC63 CAR-T细胞杀伤Nalm6肿瘤细胞和上清细胞因子检测实验结果。（数据来源：赛业生物）

五、监控体内CAR-T细胞的治疗效果

在体外验证CAR-T细胞的表型与杀伤效果后，就可以进行体内实验。将CAR-T细胞注射到肿瘤小鼠模型（比如：NSG，C-NKG，NOG等），接着取不同天数的外周血样（Peripheral blood, PB），使用流式细胞术分析，便可以监测CAR-T细胞在体内的增殖活性、细胞表型和杀伤能力。

六、总结

CAR-T疗法是肿瘤治疗领域最具前景的方向之一，是一种“治愈”癌症的治疗方法。其临床前研究需要经历多个重要的环节，而每个环节都需要严格的质控标准。近年来，随着流式细胞术的不断发展，并且基于其自身的优势特点，必将更广泛的应用于CAR-T细胞治疗产品开发的各个环节。

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