线粒体是细胞的能量代谢枢纽和信号转导交汇站，其功能异常往往会影响高耗能的组织器官（如神经和肌肉组织），也与其他细胞功能如抗病毒效应等密切相关。线粒体DNA（mitochondrial DNA, mtDNA）是线粒体中独立于核基因组的一套遗传物质。mtDNA突变被发现与包括神经退行性疾病、耳聋、肌肉萎缩等多种疾病相关，目前这类线粒体突变导致的疾病在治疗方面充满挑战。

随着基因编辑技术的发展，通过CRISPR/Cas9、单碱基编辑等技术，可实现核基因的高效编辑。多个研究团队研发了线粒体靶向定位的DNA酶（如TALEN、ZFN等），可以改变胞内mtDNA突变异质性的比例。近期研发的mtDNA单碱基编辑体系，也在细胞层次，以及动物和植物体内实现了mtDNA突变的单碱基编辑。由于单碱基编辑体系会改变同一编辑窗口中的其他碱基，导致编辑的精准性不足；同时，现有的mtDNA编辑技术，仅局限于修饰一定类型的基因突变，针对颠换、插入和缺失等类型的mtDNA基因变异，目前尚无解决方案。这些问题，限制了相关基因编辑技术在线粒体疾病动物模型建模和基因治疗等方面的应用。CRISPR/Cas9技术有望克服这些局限性。线粒体靶向的CRISPR/Cas9体系在近期研究中被报道可实现mtDNA的编辑，但这些研究都是基于基因扩增（PCR）的方式，来间接验证mtDNA分子是否被编辑。这一方法不能排除鉴定得到的被编辑的mtDNA分子来源于假阳性扩增，这也是为何关于CRISPR/Cas9技术能否编辑mtDNA仍然备受争议。

来自姚永刚团队的毕蕊博士等人，通过在Cas9蛋白上游融合线粒体引导肽，下游配置线粒体基因的3'-端非编码（3'-UTR）序列，优化建立了靶向线粒体的CRISPR/Cas9体系mito-Cas9。该体系转染细胞后，可以实现Cas9蛋白和相应的引导RNA（sgRNA）靶向线粒体的转运。研究人员在该体系中引入了包含6个碱基“GAATTC”插入的单链DNA（ssODN）同源重组模板，通过PacBio和Nanopore两种三代测序技术，对经mito-Cas9体系编辑的细胞提取的mtDNA分子进行直接建库和测序，在获得的mtDNA分子全长序列中，发现部分mtDNA基因组中含有精准插入的“GAATTC”。由于在他们采用的三代测序过程中，没有PCR扩增环节，因此，这一结果为mtDNA可以被CRISPR/Cas9体系编辑，提供了最直接的实验证据。进一步研究发现，介导同源重组修复的关键蛋白RAD51可显著提升mito-Cas9体系的基因编辑效率。采用以上mtDNA编辑体系，他们在HEK293T细胞中成功引入了mtDNA的致病变异m.3902_3908inv，这提示mito-Cas9体系在建立线粒体疾病细胞模型中具有一定的应用价值。

线粒体DNA的高效基因编辑是领域内关注的热点和难题。该研究解决了一直以来围绕“CRISPR/Cas9体系是否可以编辑mtDNA”这一问题的争议。虽然目前mito-Cas9体系对mtDNA的编辑效率还很低，离临床基因治疗预期差距甚远，但基于CRISPR/Cas9对比其他基因编辑技术的一些优势，如可编辑更多种类的突变类型、编辑精准性高等，值得后续进行深入的探索和优化，以提升mito-Cas9体系对mtDNA的编辑效率，为未来线粒体相关疾病建模和基因治疗提供工具。

相关研究结果近期发表于The innovation期刊（论文链接：https://www.cell.com/the-innovation/fulltext/S2666-6758(22)00125-4），毕蕊副研究员和姚永刚研究员为本文的共同通讯作者。毕蕊副研究员、徐敏副研究员和博士研究生李余为本文的共同第一作者。该研究工作得到上海科技大学黄行许教授、香港中文大学赵晖教授和昆明动物研究所郑萍研究员的大力支持。

该工作得到科技部、中国科学院、国家自然科学基金委和云南省的项目支持。

图1. 利用mito-Cas9基因编辑体系实现mtDNA编辑