在该研究中，研究人员通过RNAscope和免疫荧光共定位等实验充分证明足细胞损伤诱导B7-1表达上调。为研究足细胞B7-1的致病机制，他们使用了多个小鼠模型，并委托赛业生物构建了足细胞特异性表达B7-1转基因小鼠（Tg小鼠）。通过转录组测序、IP-MS分析、分子对接模拟、分离肾小球微器官培养、腺相关病毒构建基因敲除小鼠等技术手段，发现足细胞B7-1与Hsp90ab1相互作用介导β-catenin信号活化，导致足细胞损伤和肾小球硬化的网络调节机制。 

既往研究中发现肾病患者切片肾小球B7-1蛋白检测存在重复性差的缺点，为此，研究人员通过RNAscope原位杂交技术检测肾小球B7-1的mRNA水平，并通过足细胞标志物α-actinin4免疫荧光共定位明确B7-1表达上调定位于足细胞。ELISA实验检测新入院肾病患者尿液中可溶性B7-1的表达水平，发现B7-1与肾小球滤过率呈负相关关系，而与尿白蛋白水平呈正相关关系，提示B7-1与足细胞及肾小球损伤密切相关。同时研究人员还对多个肾小球疾病动物模型进行检测，结果均提示足细胞B7-1表达上调，且肾损伤关键调节蛋白β-catenin信号增强。 

图1 足细胞B7-1在多种肾小球病理条件下表达上调^[1] 

为了探究足细胞B7-1如何介导蛋白尿（Proteinuria）的发生及足细胞损伤，研究人员委托赛业公司构建了足细胞特异表达B7-1转基因小鼠（Tg小鼠）。对自然状态下多个时间点的Tg小鼠进行取材及研究发现，随着时间推移，足细胞B7-1表达上调，并伴随尿蛋白水平增加、肾小球结构改变及足细胞上皮标志物的丢失。通过转录组测序及相关验证发现Tg小鼠肾脏组织β-catenin信号活化。相反，将B7-1基因表达敲低可以抑制β-连环蛋白从而减轻足细胞损伤和肾小球损伤。 

图2 足细胞B7-1上调促进蛋白尿和足细胞损伤进展^[1] 

为了进一步探究足细胞B7-1如何通过β-catenin信号通路介导足细胞损伤，研究人员采用足细胞过表达B7-1并进行IP-MS技术鉴定分析，并通过体内外蛋白质免疫共沉淀及免疫荧光共定位等手段进行验证，发现B7-1可能通过Hsp90ab1介导β-catenin信号通路。 

图3 IP-MS及体内外实验验证足细胞B7-1与Hsp90ab1相互作用^[1] 

B7-1与Hsp90ab1究竟是如何相互作用，并介导β-catenin活化的呢，研究人员通过分子对接模拟和蛋白定点突变等方法进行验证，发现位于Hsp90ab1N端的K69位点可能是B7-1的有效结合位点，介导了B7-1的下游效应。同时，通过文献查阅发现，Hsp90ab1可能通过结合LRP5激活β-catenin,为此研究人员进一步模拟出了三者的结合构象，并对其进行了相关验证，结果显示B7-1-Hsp90ab1-LRP5复合体形成可能是介导β-catenin信号通路的重要桥梁。 

图4 分子对接模拟确定B7-1与Hsp90ab1的结合位点，B7-1通过Hsp90ab1及LRP5传递信号激活β-catenin信号^[1] 

为了进一步明确Hsp90ab1的作用，研究人员通过AAV原位注射实验干扰Tg小鼠肾脏Hsp90ab1表达水平。结果发现，敲低Hsp90ab1表达可以抑制β-catenin活化，减轻由B7-1诱导的蛋白尿和足细胞损伤。 

图5 敲低Hsp90ab1可通过抑制β-catenin信号减轻足细胞B7-1上调诱导的足细胞损伤^[1] 

β-catenin信号活化是否对B7-1也有作用呢，研究人员通过染色质免疫共沉淀的方法进行验证，发现，活化的β-catenin转位入核介导B7-1的转录调控，从而构成正反馈调节环。 

图6 β-catenin介导B7-1的转录调控^[1] 

图7 足细胞B7-1介导β-catenin信号活化诱导足细胞损伤的潜在机制^[1] 

综上所述，该研究综合了RNAscope、Tg小鼠、转录组测序、蛋白质谱测序、分子对接模拟及AAV原位注射等技术手段，充分说明了肾小球损伤诱导足细胞B7-1表达上调，继而通过B7-1与Hsp90ab1的相互作用介导B7-1-Hsp90ab1-LRP5复合体的形成，促进β-catenin活化发生酪氨酸磷酸化进一步转位入核继而引起下游级联反应。此外，β-catenin入核可以继续调控B7-1的基因转录水平，B7-1与β-catenin通路形成正反馈调节环路从而促进足细胞损伤和肾小球硬化的持续进展。