细数RHO：视网膜色素变性研究下的热门基因
上回我们提到了一种“从小孔洞里看世界”的眼科疾病，即视网膜色素变性（Retinitis Pigmentosa, RP）。随着病情加重，患者的视野会收窄变小至管状，就像透过一个小孔洞看向四周，可见范围十分有限，如此持续直至最终完全失明。作为一种慢性、遗传性的视网膜退行性病变，RP相关的致病基因就有近百个，包括视紫红质（Rhodopsin, RHO）、Usher综合征2A（Usher syndrome 2A, USH2A）和视网膜色素变性GTP酶调控因子（Retinitis pigmentosa gtpase regulator, RPGR）等。
其中，RHO合成的视紫红质与视觉电信号产生密切相关，该基因导致了约25％的显性RP遗传，是最早发现且最常见的显性RP致病基因。
RHO致病机理
RHO基因定位于3q21-24，长度为6.952kb，包含4个内含子和5个外显子，其编码的视紫红质蛋白主要在视杆细胞外节中表达，对于光信号转导至关重要。大多数RHO突变导致视紫红质在感光细胞中高表达水平，使得大量的突变蛋白细胞定位异常、聚集、蛋白质降解严重超负，造成感光细胞凋亡，不能行使正常的光信号转导功能。RHO突变型RP患者多于20岁前出现首发症状。
目前对RHO基因突变的研究认为其致病机制主要为gain of function，包括影响了：（1）视紫红质蛋白质折叠，造成内质网压力以及蛋白质聚集体形成；（2）11-顺式视黄醛结合，Ｇ蛋白偶联活化，视紫红质抑制蛋白的结合与内吞作用；（3）视紫红质的细胞运输，包括高尔基体后的运输靶向外段上膜等。
RHO基因突变类型 目前有超过150个RHO基因突变被鉴定与显性RP相关，其中错义突变为主。RHO基因突变在欧美人群尤其是美国人群中突变率最高，而在亚洲人群中突变率较低。 P23H是第一个被发现的RHO基因突变，在美国患者中约占12%，而在其他国家人群患者中却很少发现。P23H的RHO基因突变导致蛋白不能正确折叠，造成内质网压力及细胞毒性，最终导致视杆细胞退化。视紫红质蛋白末端的347编码区则是另一个基因突变的热点，有6个不同的突变类型：P347T、P347A、P347S、P347Q、P347L、P347R，其中P347L最常见，在显性RP中突变率为3.6%，仅次于P23H，国内研究报道P347L是一个较常见突变位点[2]。 RHO突变分为两类：A类突变导致早期丧失夜间视力和整个视网膜的视杆功能异常；B类突变会导致更缓慢的疾病进展，患者至少在视网膜的某些部分将正常的视杆感光细胞保留到成年期。从临床表型来看，P347L较P23H更严重[10]。 由于受影响细胞的生存能力延长，B类突变患者更适合进行基因治疗。对于显性疾病，治疗可能需要抑制突变等位基因以避免其抑制作用；或通过基因校正，使用基因编辑来同时实现基因扩增和突变抑制。几乎所有特征化的RHO突变体都是显性的，因此可能需要沉默突变等位基因以防止失明，同时需要增加正常基因表达以便更好地治疗疾病[3]。 RHO现有基因疗法盘点 动物模型的应用有助于推动RHO相关的潜在治疗方法向临床试验进一步转化，该基因突变导致的adRP啮齿动物模型包括：含有T17M、P23H、S334X或P347S等突变的人源化大小鼠模型。目前，靶向RHO基因以治疗RP的基因疗法有siRNA、ASO、CRISPR等。 ▶siRNA疗法 文献中出现siRNA疗法，但未见管线，该疗法是一种表达shRNA的载体（抑制突变基因表达）和另一种表达替换视紫红质的载体（递送正常基因）对P347S和P23H转基因小鼠进行视网膜下注射，其中，shRNA能导致人类P23H-RHO转基因小鼠中视紫红质的50%抑制。与未经过治疗的眼睛相比，用组合载体治疗的眼睛的总视紫红质含量增加了两倍，并在治疗后9个月内保护ERG反应[11]。 ▶ASO药物 ProQR公司的ASO药物QR-1123治疗与P23H RHO突变相关的adRP的临床试验正在进行中（ClinicalTrials.gov标识符：NCT04123626），疾病模型为P23H转基因大小鼠[9]。ASO可以通过靶向特异性基因序列调控蛋白质表达。特异性ASO可能仅对特定突变患者群体有用，但由于ASO的开发比病毒介导的反义技术更容易，因此如果存在测试系统（动物模型或类器官模型），开发针对罕见突变的治疗性ASO是可行的[8]。 ▶CRISPR基因编辑 有文献表明shRNA疗法中小鼠视觉功能出现部分改善，然而相关研究结果对比并非十分明显，或因RHO为活跃基因，在mRNA水平上干扰调节蛋白质水平具有挑战，故而基因组编辑技术成为RHO基因治疗研究热点。 张锋创立的Editas公布了其体内基因编辑疗法EDIT-103用于治疗由于RHO突变导致的RP[12]。EDIT-103是一种不依赖于突变的基于CRISPR/Cas9的基因编辑疗法，使用双AAV5载体递送来敲除和替换视紫红质基因中的突变，以保持感光器功能，可通过视网膜下注射给药。该疗法有望解决150多种可导致RHO adRP病的RHO功能获得型的突变。CRISPR疗法的相关文献中使用到的小鼠模型有P23H、P347S转基因小鼠，hRHOC110R/WT人源化小鼠，同时具有多个突变的人源化小鼠模型等[4,5,6,7]。不难发现，CRISPR疗法中，疾病模型携带人突变基因是重要的共同因素，且人源化疾病模型小鼠在CRISPR治疗中地位越来越重要。 基于自主研发的TurboKnockout融合BAC重组的技术创新，赛业生物可以提供RHO人源化及热点突变人源化小鼠，以满足广大研发人员关于RP疾病的药效学等实验需求。
眼科基因治疗动物模型推荐 在RHO基因突变导致的RP中，可应用的基因疗法较多，且目前大多基因治疗处于临床前期，发展前景乐观。关于研发阶段中所使用到的动物模型，人源化小鼠无疑是大多数科研及药企人员更青睐的选项，相信赛业生物为此布局的RHO人源化及热点突变人源化小鼠能带来更多的助力。 疾病名称 打靶基因 打靶类型 视网膜色素变性 RHO KO、CKO、Humanization、Humanization(Mu) Mertk KO、CKO Rpgr KO Crb1 KO Rd1(Pde6b) KO、MU Rd10(Pde6b) MU RP2 KO、CKO 黄斑变性 VEGFA KI、TG ABCA4(ABCR) KO、Humanization 视网膜变性 Tub KO 缓慢进展型视网膜变性 Rds(Prph2) KO 先天性黑蒙症2型 Rpe65 KO、MU 先天性黑蒙症4型 Aipl1 KO 先天性黑蒙症10型 CEP290 Humanization 先天性黑蒙症13型 Rdh12 KO 全色盲 Cnga3 CKO 角膜内皮营养不良 TCF4 CKO、Humanization 先天性无虹膜症 Pax6 CKO 无脉络膜症 Chm CKO Usher综合征 USH2A Humanization Myo7a CKO 卵黄样黄斑变性 Best1 KO 遗传性视网膜劈裂症 Rs1 KO、CKO 眼皮肤白化病1型 Tyr CKO 眼皮白化病3型 Tyrp1 KO、CKO Wolfram综合征 Wfs1 KO、CKO 弹力纤维假黄瘤 Abcc6 KO、CKO 注：KO：基因敲除；CKO：条件性敲除；MU：基因点突变；Humanization：人源化
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