斑马鱼×哺乳动物，融合开辟营养保健食品研发新路径

内容

自从我国加入了WTO后，动物福利问题一度成为我国与世界接轨的一个瓶颈，并引起越来越多的关注。根据《欧盟动物保护法》提出的3R原则，越来越多的非动物模型被人们熟知并使用。因此，更多的科学研究开始使用非动物模型结合动物模型进行体内和体外研究。

在过去的十几年里，斑马鱼（Danio rerio）在科学研究中的使用增长非常迅速。最初，因为斑马鱼胚胎通体透明，发育迅速且是一种脊椎动物发育的模型而受到广泛使用。而现如今，由于5天以内的斑马鱼胚胎和幼鱼自带卵黄囊，无须进食，符合3R原则，斑马鱼实验更受欢迎。因此，斑马鱼模型的应用正在扩展到其他领域，例如药物、保健食品的机制研究、疾病模型临床研究及新兴药物研发等等。

那么，斑马鱼模型结合哺乳动物模型进行保健食品功能的研究的优势如何呢？本文将从中枢及免疫相关、减肥及降三高相关、口服美容相关、消化系统相关、机体损伤相关五大类别简述斑马鱼模型结合哺乳动物模型在保健食品功能研究方向的应用。

图注：《允许保健食品声称的保健功能目录非营养素补充剂（2023年版）》五大分类归纳

01、中枢及免疫相关

1.1 免疫系统

硬骨鱼是目前已知的最低等且兼具固有与适应性免疫系统的脊椎动物。斑马鱼造血机制研究的结果表明，人类与斑马鱼在免疫系统的细胞组成上极为相似。另外，斑马鱼的免疫器官与哺乳动物有所不同[1]。斑马鱼的适应性免疫系统在受精后的4-6周后才出现，胚胎发育中出现了一个仅具有固有免疫的特殊时期。斑马鱼的肾是免疫细胞发生的主要器官，类似于人类的骨髓，并在其中发现有T细胞、B细胞及树突状细胞的存在。

斑马鱼具有类似哺乳动物的胸腺皮质结构Thymoids，其肾脏与胸腺一起构成斑马鱼的中枢免疫器官。在哺乳动物上，淋巴结是抗原递呈细胞（Antigen presenting cells，APCs）与淋巴细胞进行信息交换的重要场所。虽然斑马鱼缺乏淋巴结，但其脾、肝和肠可代替淋巴结作为APCs与淋巴细胞交换信息的场地，从而构成次级免疫器官。因此，斑马鱼模型具备发育完善的免疫系统，但由于针对斑马鱼的抗体标记等技术尚未普及，对其免疫功能调节的相关功效分析方法还不成熟。

哺乳动物的免疫系统主要分为两个部分：先天性免疫和适应性免疫。先天性免疫系统是哺乳动物通过遗传获得的，并且在生命早期就已经发育成熟，包括固有免疫细胞如：巨噬细胞、自然杀伤细胞、树突状细胞、嗜酸性粒和乙酰胆碱受体细胞等非特异性免疫细胞，主要负责直接识别和清除外来病原体。而适应性免疫系统则通过“记忆"机制进行工作：一旦身体感染某种病原体后，适应性免疫系统中的各类特异性免疫细胞就会产生“记忆"，从而能够更好地预防同类病原体重复感染。小鼠是常用的免疫反应模型动物，比如迟发型变态反应模型，但该模型在小鼠上表现不规律，且缺乏人类典型的表皮过敏反应。除此之外，小鼠也能诱导速发型变态反应模型，表现为循环不畅，循环性虚脱等全身性过敏反应，常在几小时甚至10到20分钟死亡。而大鼠免疫模型相对斑马鱼的特点在于血液中可检出反应素抗体IgE：常规的免疫法只能使大鼠产生少量反应素，在体内存在的时间较短，但蠕虫感染等刺激性抗原常能诱发大鼠体内产生大量的IgE抗体，所以应该因地制宜地进行模型构建。

因此，可以利用斑马鱼模型进行大量保健食品增强免疫力功效的初筛，结合哺乳动物不同疾病模型靶向精准地进行相关免疫功效机制的研究。

1.2 视觉系统

斑马鱼胚胎期的视觉系统发育非常迅速，5dpf的幼鱼具有非常成熟的视觉系统和视觉介导的行为。同时，斑马鱼还具有与人类相似的锥形视网膜和色彩视觉。因此，可以利用斑马鱼对眼毒性和视功能进行评价[2]。

研究人员通常采用眼动反应和视动反应对斑马鱼的视觉功能进行分析。眼动反应和视动反应均属于视觉刺激诱发性行为，无需训练即可诱导产生，人类亦具有以上两种反应。已有研究表明斑马鱼检测眼毒性的准确性高达70%[3]。lumican基因编码光蛋白聚糖，是巩膜细胞外基质的重要组成成分，对巩膜生长代谢及维持巩膜正常结构具有重要调节作用。近视眼巩膜的重塑与巩膜细胞外基质的活动明显相关，lumican基因缺失，会造成巩膜过度扩张。斑马鱼lumican基因沉默可很好地复现近视表型。

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常见视觉缺陷模型动物的眼球结构和发育特点存在差异，以致其在视觉研究中的认可度不高。人类视网膜包含视杆细胞和三个视锥光感受器亚型，对蓝光、绿光或红光敏感，这意味着人类是三色光。但斑马鱼是昼夜四色动物，具有对紫外线、蓝光、绿色和红光敏感的视锥光感受器。斑马鱼视网膜富含视锥细胞并且具有相同的感光器类型，发育中的斑马鱼视网膜在受精后2.5 dpf表达视蛋白，幼鱼可对5 dpf的视觉刺激做出反应。所以斑马鱼和人类视网膜之间的相似性，因此越来越多的科学研究使用斑马鱼模型进行视力缺陷研究。

目前C57BL/6J小鼠和有色豚鼠是应用广泛、成本较低的视觉缺陷哺乳动物模型。小鼠眼球结构与人类相似，同时具有完整的基因组信息和成熟的基因操控方法，但是小鼠眼球小，屈光介质的光学质量差，一般需要步进电机式光学相干断层扫描仪等设备才可准确测量小鼠的活体眼球参数。另一方面，豚鼠眼球发育的过程也与人类高度相似，且眼球较大，更有利于眼部参数的测量，但豚鼠饲养过程中需注意及时补充维生素及维持饲养环境清洁。

1.3 中枢系统

斑马鱼大脑系统在生理学、脑解剖学和神经化学方面都与人类的特征基本相同。鱼类大脑中没有类似哺乳动物的海马体结构或三突触回路的区域，但硬骨鱼的侧脑皮层被认为与哺乳动物海马相似，已经被证明能够获得和记忆空间信息。内侧大脑皮层已经被发现在功能上和在某种程度上与哺乳动物的杏仁核（恐惧和其他情绪的中心）相似。斑马鱼不仅表现出短期记忆，而且还表现出长期记忆，以及联想和社会学习，斑马鱼是研究学习和记忆的生物机制的最佳模式生物之一。与人类相当的行为表现如运动活动、焦虑样行为、学习、记忆保留、空间和物体识别、恐惧反应、社会偏好和互动等，都能在斑马鱼身上得到体现。

大小鼠具备高度发达的神经系统，主要表现在大脑和小脑体积相对斑马鱼更大，且脑表面存在皱褶以大幅增加了皮层的表面积，并能形成与人类神经系统近似的复杂结构，包括了高级神经活动中枢，神经元之间的复杂网络结构，两大脑半球之间的横向神经纤维（即胼胝体）以及小脑半球等。因此，以大小鼠为代表的哺乳动物模型具备认知行为、情绪活动、学习记忆等高级神经活动的脑结构基础。

整体来说，斑马鱼虽在幼鱼时期神经发育尚不完善，无法完成精密行为检测，但可以利用该模型进行神经系统多靶点的初筛，并结合哺乳动物模型对行为学及精准靶向机制进行深入研究。

02、减肥及降三高相关

体内脂质过多可引起肥胖、高血压、糖尿病、冠心病、高脂血症和睡眠呼吸暂停等疾病。哺乳动物因个体饲养固有成本，其肥胖症模型很难用于高通量筛选。Jones等人先前提出了斑马鱼胚胎卵黄囊内的脂肪含量可以用作指标来筛选调节脂肪代谢的药物[4]。他们用Nile Red染料来定量脂肪，检测了一些已知的促进脂肪代谢的药物，包括PPAR激动剂、乙型肾上腺素激动剂、SIRT-1激动剂和烟酸。结果显示这些药物都能促进斑马鱼的脂肪代谢，说明斑马鱼可以用于脂质类疾病的高通量筛选[5]。

哺乳动物的脂肪消化主要发生在胃和小肠中。其中胃部的胃酸和胃蛋白酶主要起到破坏脂肪细胞结构和降低脂肪粒子大小的作用，而经胰腺分泌至小肠内的胰岛素和胰脂酶则是脂肪消化的关键。胰岛素主要作用于脂肪细胞膜，使其通透性增加，从而促进脂肪酸的释放。胰脂酶则通过水解脂肪酯的酯键，将脂肪分解为甘油和脂肪酸。此外，小肠壁上的微绒毛也具有吸收脂肪的功效，在营养吸收过程中，小肠绒毛长度增加也是评价脂肪吸收增量的一个重要病理学指标。

哺乳动物实验通过评价血清总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇和甘油三酯等指标来判定高血脂模型是否成立，相对于斑马鱼模型来说，哺乳动物模型的脂肪代谢途径与人类更相似，而斑马鱼高血脂模型则具有可视化优势。因此可以利用斑马鱼模型进行保健食品减脂降三高功效的高通量初筛，再结合哺乳动物靶向精准地进行相关功效评价与机制研究。

03、口服美容相关

斑马鱼表皮具有一定的渗透压耐受范围，超过耐受范围将产生脱水现象，尾部面积也会变小，因此，使用高渗透溶液可以建立斑马鱼补水保湿的诱导模型。水通道蛋白（Aquaporin, AQP）广泛存在于生物体的各组织部位，影响着生物体水代谢的过程。AQP3在表皮基底及棘突层的角质形成细胞质膜中高度表达，并在这些质膜中作为水、甘油运输蛋白，促进皮肤水合作用。人类透明质酸合成酶是一类在透明质酸合成过程中发挥重要作用的酶，HAS3在表皮透明质酸的合成中起主要作用。分析斑马鱼尾部面积，检测HAS3、AQP3基因表达量，可评价保湿功效。

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哺乳动物的皮肤由表皮和真皮组成，表皮的表层为角质层，包括了腺体、毛、角、爪、甲、蹄等结构，深层为活细胞组成的生发层。真皮由胶原纤维及弹性纤维的结缔组织构成，这两种纤维交错排列，其间分布有各种结缔组织细胞、感受器官、运动神经末梢及血管、淋巴等。整体来说，大小鼠与人类除毛发长度外，在表皮与真皮结构上基本一致。但也因此大小鼠进行皮肤状态的研究会极大地受到动物自身及环境的影响，比如其毛发生长速度会显著影响透皮吸收效率。同时大小鼠存在日常自身清洁行为，对以涂抹给药方式为主的化妆品实验而言，如何让受试样品（尤其是有一定刺激性的）在其表皮停留24小时也是一个技术难点。

因此，推荐使用斑马鱼模型进行皮肤水分、痤疮、黄褐斑等表型损伤以及安全性研究，利用哺乳动物模型进行皮肤表皮和真皮层细致的研究。

04、消化系统相关

斑马鱼没有单独的胃，食道较短，大部分为肠道。斑马鱼的消化系统和哺乳动物类似，斑马鱼的胰腺也分为外分泌腺和内分泌腺两部分，由腺管连接到消化道。斑马鱼胰岛的核心区域是产生胰岛素的β细胞，周围有产生胰高血糖素的α细胞、δ型细胞（产生促生长素抑制素）和ε细胞（产生生长素释放肽）。主胰岛在受精后24小时形成，第二胰岛将在受精后5天左右开始形成，而后者是构成成鱼胰腺的主要部分。已有研究表明斑马鱼内几个基因的错乱会影响β细胞的发展，而且在某些情况下，其表现出来的表型和人类相关疾病十分相似。Ng等研究发现[6]，斑马鱼在受精后5天，其肠道的管腔形成，并不断生长，内胚层分化形成了有功能的肠道上皮。在未喂食时，斑马鱼胚胎的肠道即开始游走性蠕动。由于斑马鱼早期体外发育，全身透明，所以其胃肠蠕动均可直接观察。

哺乳动物的消化系统包括消化管和消化腺。胃是哺乳动物消化道的重要部分，其形态常因食性的不同而变化。小肠起营养物质吸收作用。大肠保护和润滑肠壁，以利粪便排出。消化腺哺乳动物的消化腺除3对唾液腺外，在横隔后面，小肠附近还有肝脏和胰脏，分别分泌胆汁和胰液，注入十二指肠。肝脏除分泌胆汁外，还有贮存糖原、调节血糖，使多余的氨基酸脱氧形成尿及其他化合物，将某些有毒物质转变为无毒物质，合成血浆蛋白质等功能。整体来说，哺乳动物模型的消化系统从器官分布和功能分类上都和人类高度一致，但相较于斑马鱼模型而言，可视化方面需要更复杂的设备进行影像学分析检测。

因此，推荐使用斑马鱼模型进行肠道功能的研究，利用哺乳动物模型进行胃及肠道的研究。

05、机体损伤相关

5.1 骨骼

目前在骨骼研究领域已成功建立许多种类的动物骨骼模型，以骨质疏松模型为例，有报道的动物模型包括啮齿类动物、兔、犬、灵长类动物以及硬骨鱼类等。Fleming等人[7]在2005年通过对斑马鱼头部骨骼发育的观察证明斑马鱼模型可以用于筛选促进骨骼发育的药物。至此‚斑马鱼作为高效、快速、高通量筛选促进骨骼生长、治疗骨科疾病药物的体内模型受到研究人员关注。由于硬骨鱼和人类在骨骼发育过程中的基因、信号通路有高度同源性，而且与其他的动物模型相比，斑马鱼具有个体小，适合高通量化学筛选、幼鱼身体透明易于观察骨骼发育的特点，所以近年来以斑马鱼为模型的骨骼研究逐渐成为这一领域的热点[8]。

哺乳动物骨骼系统是由一系列骨组织和软骨组成的硬组织。它为哺乳动物提供支撑、保护和运动的功能。哺乳动物的骨系统包括头骨、脊柱、肋骨、前肢骨和后肢骨等部分。哺乳动物骨系统是一个复杂而精妙的结构，自身具有较强的抗感染及耐受手术的能力，且围手术期易于管理，制作骨缺损模型具有一定优势。但其不能完全模拟人类的骨骼重建过程，因此不宜用在研究骨骼系统的形态、功能和组织性质方面的实验。

5.2 肝脏

肝脏是斑马鱼最大的腺体，斑马鱼在受精后72小时，斑马鱼肝脏的形态和功能全部发育完全。在斑马鱼肝脏中，存在多种与哺乳动物同源的脂质代谢酶，包括HMG-CoA合成酶和HMG-CoA裂解酶氧化物酶等[2]。人类过多摄入能量导致脂肪肝，因此通过喂养诱发构建斑马鱼肥胖模型与人类更接近。通过喂养高脂饲料等诱发的模型会出现体重、体质指数、甘油三酯、总胆固醇等表达升高的现象。采用油红、尼罗红和荧光探针方法可间接反映脂质含量，更直观进行结果的反馈[9]。除此之外，饲喂高脂饮食还可构建斑马鱼肝纤维化模型。由于大多数肝纤维化相关蛋白在人类和斑马鱼之间是保守的，意味着在斑马鱼体内有与人体内相同的发挥活性的药物分子靶标。且斑马鱼是胚胎透明的，可监测标记的单个细胞甚至整个肝。在体式显微镜下，斑马鱼幼鱼早期肝纤维化主要表现为肝变小。随着药物处理时间延长，肝组织内出现胶原纤维沉积现象[10]。

常用于研究肝脏的哺乳动物有大鼠、小鼠、家兔等，其中包括饮食诱发（高脂饮食、高果糖饮食、蛋氨酸和胆碱缺乏饮食）、药物诱发（链脲佐菌素、四氯化碳、脂多糖以及四环素）和特殊模型等，动物伴有躯干肥胖并出现肝脂肪变性增加及明显的纤维化等现象。实验动物喂食高脂饮食所构建的模型与人类普遍脂肪肝相似，尤其是组织学改变，如脂肪变性和肝细胞气球样变等相似。然而，饮食模型耗时普遍较长（30~45日的重复给样周期），且个体实验动物的摄入量差异和敏感度差异会使哺乳动物模型在表型上的一致度更低。

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综上所述，我们建议在保健食品原料筛选、配方组合、功效初筛及功效展示等方向使用斑马鱼模型，在保健食品配方确定、功效验证、药代动力学研究、剂型比较、机制研究等方向使用哺乳动物模型。当然，通过使用斑马鱼模型结合哺乳动物模型研究保健食品的功效和安全性预测性将大大提升。

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参考文献：

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[3] Richards FM, Alderton WK, Kimber GM, Liu Z, Strang I, Redfern WS, Valentin JP, Winter MJ, Hutchinson TH. Validation of the use of zebrafish larvae in visual safety assessment. J Pharmacol Toxicol Methods. 2008 Jul-Aug;58(1):50-8. doi: 10.1016/j.vascn.2008.04.002. Epub 2008 May 2. PMID: 18541443.

[4] Jones KS, Alimov AP, Rilo HL, Jandacek RJ, Woollett LA, Penberthy WT. A high throughput live transparent animal bioassay to identify non-toxic small molecules or genes that regulate vertebrate fat metabolism for obesity drug development. Nutr Metab (Lond). 2008 Aug 27;5:23. doi: 10.1186/1743-7075-5-23. PMID: 18752667; PMCID: PMC2531115.

[5] 辛胜昌,赵艳秋,李松等. 斑马鱼模型在药物筛选中的应用 [J]. 遗传, 2012, 34 (09): 1144-1152.

[6] Ng AN, de Jong-Curtain TA, Mawdsley DJ, White SJ, Shin J, Appel B, Dong PD, Stainier DY, Heath JK. Formation of the digestive system in zebrafish: III. Intestinal epithelium morphogenesis. Dev Biol. 2005 Oct 1;286(1):114-35. doi: 10.1016/j.ydbio.2005.07.013. PMID: 16125164.

[7] Fleming A, Keynes R, Tannahill D. A central role for the notochord in vertebral patterning. Development. 2004 Feb;131(4):873-80. doi: 10.1242/dev.00952. Epub 2004 Jan 21. PMID: 14736741.

[8] 李振华,Deepa Alex,徐燕玲等. 斑马鱼:新型骨骼研究模式生物 [J]. 中药药理与临床, 2010, 26 (03): 67-71. DOI:10.13412/j.cnki.zyyl.2010.03.026

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[10] 王洁,冯驰,董武等.斑马鱼肝纤维化动物模型研究进展[J].中国实验动物学报,2023,31(04):531-540.