科研鱼论丨斑马鱼在新污染物毒性评价中的国际前沿应用进展

内容

自2022年5月《新污染物治理行动方案》发布以来，我国新污染物治理步入“快车道”。新污染物，主要包含持久性有机污染物、内分泌干扰物、抗生素、微塑料四大类，具有生物毒性、环境持久性、生物累积性等特征，对生态环境或者人体健康存在较大风险，甚至会引起广泛的毒理学和生物学效应，包括发育毒性、内分泌干扰、免疫毒性、致癌性和生殖受损等。

近年来，斑马鱼作为国际公认的毒理学研究模型，其与人类基因同源性高达87%，对有毒有害物质非常敏感，并具有周期短、高通量、毒性评价指标多样化等独特优势，被广泛应用于毒性检测、分子及细胞生态毒理研究、生物诱导效应检测及新污染物毒性评价等方面。

01、斑马鱼在新污染物领域的研究方向

当前，随着大规模工业发展和人类活动的增加，全球环境污染问题日益严重。其中，新污染物在环境中主要以痕量/超痕量的形式存在，仅靠化学检测方法无法有效评估污染物复合暴露产生的环境风险，因此，如何选择高灵敏度、高特异性的检测方法，识别新污染物的毒性效应，评估潜在环境风险，一直是新污染物治理面临的重要挑战。

通过构建斑马鱼胚胎毒性、急性毒性、神经毒性、生殖毒性、子一代生殖毒性、雌激素快筛、氧化应激、炎症模型等，来研究新污染物的生物毒性、器官富集和器官毒性，单种、多种新污染物的生物毒性、复合毒性及机制、毒性缓解措施，快速定性定量筛查样品中的雌激素，并应用于环境风险筛查和评估，为新污染物的评价提供了方便、有效的方法。

研究新污染物的生物毒性、器官富集和器官毒性

胚胎毒性、急性毒性等毒性模型可用于研究新污染物的毒性情况和毒性靶器官。由于斑马鱼胚胎对外界毒性敏感，能迅速反应样品的毒性情况，从而判断样品的的毒性情况。

在利用斑马鱼胚胎评价环境新污染物的生物毒性及器官毒性时，通过观测经毒性物质染毒条件下鱼卵胚胎心跳的情况，可以判断鱼卵胚胎发育的毒性效应；通过观察斑马鱼器官畸形、突变及死亡情况等，也可以评估样品的毒性情况。

研究单种新污染物的生物毒性及机制

通过单种新污染物给药，结合毒性模型和凋亡细胞、切片、基因、蛋白等检测手段，对新污染物的生物毒性机制进行研究。

在利用斑马鱼进行凋亡细胞检测时，对斑马鱼身体各部分凋亡细胞进行荧光染色，通过低荧光强度的定量判定斑马鱼各器官凋亡细胞情况，从而判定新污染的毒性和靶器官；在利用斑马鱼进行器官组织变化观察时，对斑马鱼组织切片，通过阅片判定斑马鱼器官组织的变化，从而判定新污染的毒性和靶器官；利用分子通路研究时，通过代谢组学分析新污染物暴露后斑马鱼体内蛋白的变化，从而判断毒性机制。

研究多种新污染物的复合生物毒性及机制

通过多种新污染物复合给药，结合毒性模型和凋亡细胞、切片、基因、蛋白等检测手段，对新污染物的复合生物毒性机制进行研究。

通过对斑马鱼的行为分析，评估样品的神经毒性，判断新污染的毒性机制；参考OECD，通过检测斑马鱼性腺切片、性激素水平、基因表达水平判断样品的生殖毒性，评估新污染物的毒性机制；参考ZEOGRT，通过子一代的孵化、死亡情况，器官畸形情况的检测，评估样品的子一代生殖毒性，判断新污染物的毒性机制；通过荧光染色斑马鱼体内自由基（ROS），评价斑马鱼的氧化应激水平。

快速定性定量筛查样品中的雌激素

通过雌激素快筛模型可快速筛查样品中雌激素的情况。当雌激素荧光斑马鱼暴露在有雌激素的样品中时，斑马鱼肝脏部位会产生绿色荧光，通过荧光的强弱可以反映产品中雌激素含量，从而快速筛查样品中雌激素的情况。下图为雌激素处理后斑马鱼荧光表型图——

通过克隆斑马鱼雌激素响应元件ERE的DNA序列，并在胚胎显微下注射构建的质粒Tol25×EREGFF，通过Founder筛选培养得到转基因雌激素绿色荧光斑马鱼Tg(5×ERE:GFF;UAS:EGFP)。所得转基因斑马鱼，在雌激素刺激下，5×ERE响应，激活GFF的表达，而GFF蛋白可与UAS结合，进而驱动绿色荧光蛋白（EGFP）的表达，从而达到方便、直观、动态检测环境雌激素是否存在及其浓度的目的。

研究新污染物的毒性缓解措施

通过缓解剂和新污染物同时给药，采用毒性模型和凋亡细胞、切片、基因、蛋白等检测手段，对缓解剂的效果进行研究。通过中性粒细胞荧光鱼、巨噬细胞荧光鱼的聚集情况，检测斑马鱼体内炎症相关基因的表达水平，评价斑马鱼的炎症水平。

02、斑马鱼在新污染物的应用进展

当前，持久性有机污染物、内分泌干扰物、抗生素、微塑料是环境中普遍存在的新污染物，由于其大量应用于人类生产和生活中，并通过机体代谢排放，已经对环境造成持续的污染。

近年来，利用斑马鱼开展对新污染物毒性评价及生物健康效应的研究，对保护环境及促进生命健康发展具有重要意义，为有效解决和控制新污染物提供了越来越多的理论支撑。环特生物依托于10多年的基因编辑及斑马鱼技术服务经验，致力于为客户构建斑马鱼新污染物毒性评价模型，涵盖斑马鱼胚胎毒性、急性毒性、神经毒性、生殖毒性、子一代生殖毒性、雌激素快筛、氧化应激、炎症模型等百余种常见斑马鱼模型，服务客户数量超过20000家，让新污染物科学研究事半功倍。斑马鱼在新污染物的国际前沿应用进展如下——

斑马鱼在持久性污染物上的应用

全氟丁烷磺酸(PFOS)是一种新型的持久性有机污染物，对鱼类甲状腺内分泌系统具有一定的损害效应，并可以干扰鱼类肠道菌群组成，导致脂质代谢障碍等。目前，全世界范围内被调查的水体、沉积物和生物体内都检测出存在PFOS 等全氟类化合物污染的踪迹。

研究对象：全氟丁烷磺酸与益生菌对斑马鱼甲状腺内分泌系统的联合效应研究

益生菌能在一定程度上减轻环境污染物对生物体造成的危害，但其能否调节PFBS的甲状腺内分泌干扰效应尚不清楚。研究中，通过将成年斑马鱼暴露于不同质量浓度（0、10和100μg/L）PFBS的养殖水中28d，投喂添加或不添加益生菌（鼠李糖乳杆菌）的饲料，测定亲代下丘脑-垂体-甲状腺轴关键基因，以及亲代大脑、血液和子代胚胎中甲状腺激素水平，以探究PFBS与益生菌共暴露对斑马鱼甲状腺内分泌系统的联合效应。

结果显示，在激素水平上，PFBS降低了亲代血液T3水平，而添加益生菌能减轻雄鱼血液T3水平的降低；在基因水平上，100μg/L PFBS与益生菌共暴露促进雄鱼大脑tshβ基因表达以应对低水平的T3，并与相应PFBS单独暴露相比差异显著，表明添加益生菌可以减轻高质量浓度PFBS诱导的雄鱼大脑T3水平的降低；PFBS单独暴露能上调雌鱼大脑trα基因表达，而PFBS与益生菌共暴露则上调trα和trβ基因表达，表明添加益生菌能使机体积极地应对PFBS诱导的雌鱼大脑T3水平降低。

研究发现PFBS单独暴露能引起斑马鱼的甲状腺内分泌系统紊乱，而PFBS与益生菌共暴露后，益生菌能在一定程度上通过甲状腺激素水平和基因表达调节PFBS的毒性效应，为后续PFBS毒性效应的研究及毒性缓解措施的开发提供了重要参考。

来源：全氟丁烷磺酸与益生菌对斑马鱼甲状腺内分泌系统的联合效应研究

斑马鱼在内分泌干扰物上的应用

环境内分泌干扰物 (EDC) 是一种外源性持久性有机污染物，会干扰内分泌系统的功能以及激素的合成、释放和代谢。EDCs应用于工业、农业和日常生活中。然而，这些化学品的不当处置导致了多种 EDC（例如，表面活性剂烷基酚、增塑剂邻苯二甲酸酯、阻燃多溴联苯、杀虫剂和合成树脂材料双酚等）的持续释放。与其他 EDC 相比，这些污染物在水生环境（例如，地表水、地下水和废水）中的普遍性和高含量的出现令人担忧，并且可能造成环境影响，进而转化为对水生动物的不利影响，海洋生物、水生生态系统和人类健康。

研究对象：常见环境内分泌干扰物对斑马鱼行为的影响

该研究系统综述了EDCs对斑马鱼行为的影响及其机制。在现有文献基础上，总结了典型EDCs（包括壬基酚、邻苯二甲酸盐、阻燃剂、有机磷杀虫剂、有机氯虫剂和双酚等）在水环境中的检出水平及其对不同发育阶段斑马鱼行为的影响，包括运动活动、社交行为、记忆和焦虑相关行为以及求爱行为。列举了斑马鱼暴露于EDCs的行为终点，从乙酰胆碱酯酶、多巴胺和氧化应激三个方面提出了EDCs对斑马鱼行为调控的潜在分子机制，确定了EDCs对斑马鱼的神经毒性作用，概述了斑马鱼行为检测在神经科学研究中应用（图1），分析了EDCs复合污染对斑马鱼的潜在风险。最后，提出了EDCs对斑马鱼行为影响研究的不足和今后的工作建议。

来源：Effects of common environmental endocrine-disrupting chemicals on zebrafish behavior

研究对象：双酚A干扰斑马鱼内耳发育的非雌激素作用机制

双酚A (Bisphenol A, BPA)是双酚类化合物家族中重要成员，被广泛用于生产塑料和环氧树脂消费品，包括水瓶、餐具和食品容器。自1936年首次在大鼠上观察到BPA的类雌激素作用以来，BPA的类雌激素效应已经在人类及多种动物模型中得到证实，是最具代表性的雌激素内分泌干扰物。近年来，越来越多的研究人员利用斑马鱼模型开展鱼类生殖生理、内分泌学研究，包括环境内分泌干扰物的作用及其机理，尤其是将基因编辑技术用于环境科学研究。

研究人员以斑马鱼雌激素核受体（esr1, esr2a, esr2b）和膜受体（gper1）敲除系为研究模型，提供了全面的遗传和分子证据，证明BPA诱导的斑马鱼耳石发育异常不是通过干扰雌激素信号，而是通过非雌激素受体信号通路激活MEK/ERK-EZH2-H3K27me3信号通路，从而抑制otop1和stm的基因表达（图5）。该研究还表明，斑马鱼作为最常用的生物模型之一，是研究环境污染物及其分子作用机制的良好体内模型。

来源：Genetic and Epigenetic Evidence for Nonestrogenic Disruption of Otolith Development by Bisphenol A in Zebrafish

研究对象：胚胎期双酚A暴露对斑马鱼眼结构及视觉功能影响的研究

内分泌干扰物的研究目前已成为国际研究新的热点，探究胚胎期双酚A(BPA)暴露对斑马鱼眼结构及视觉功能的影响，为环境污染物暴露致子代视觉损害提供理论依据。

通过构建胚胎期BPA暴露斑马鱼模型，体视显微镜观察并测量幼鱼的眼面积、眼长、体长；HE染色检测幼鱼视网膜结构变化；;斑马鱼行为学检测系统评估幼鱼视觉行为。

结果:(1)50μmol·L-1BPA暴露后幼鱼眼面积、眼身长比显著减小；(2)BPA暴露后幼鱼视网膜细胞排列拥挤，分层紊乱，感光细胞层细胞排列不齐；(3)受精后24h(24 hpf)BPA暴露组的斑马鱼胚胎摆尾活动减少；96、120hpf幼鱼动眼频率和幅度降低；120、144hpf幼鱼自主运动能力显著下降，游泳距离显著缩短。该研究表明，胚胎期BPA暴露可造成斑马鱼眼结构的改变和异常的视觉行为，说明环境污染物会影响子代视觉的发育，提示儿童眼保健应从孕期保健开始。

来源：胚胎期双酚A暴露对斑马鱼眼结构及视觉功能影响的研究

斑马鱼在抗生素上的应用

研究对象：抗生素在斑马鱼模型中的代际传播机制

尽管已知各种抗生素对水生生物具有直接毒性，但代际传播对生殖的潜在慢性影响仍然难以捉摸。在这里，我们将斑马鱼暴露于15种常用抗生素的混合物中，其浓度与环境相关（1和100μgL–1） 采用交叉配接设计。在卵巢中检测到抗生素的大量积累（高达 904.58 ng g–1）和睾丸（高达1704.49 ng g–1） 的 F0 鱼。抗生素从 F0 代到下一代（F1 后代）的传播得到证实，传播率 （k我），范围从 0.11 到 2.32。

与父系转移相比，母体抗生素转移明显更高，因为与睾丸富集相比，通过卵巢富集和产卵传递的作用更大。在雌性和雄性父母接触后发现的F1卵子的生殖和发育指标也有类似的损害。与F1相比，几乎所有抗生素都在F2卵子中被消除。然而，在F2鱼中仍然观察到生殖和发育毒性反应，这表明抗生素浓度水平不是评估每一代毒性作用的唯一标准。这些发现揭示了抗生素在鱼类模型中的代际传播机制，并强调了它们在水生环境中的潜在和持久影响。

来源：Unraveling the Marine Microplastic Cycle: The First Simultaneous Data Set for Air, Sea Surface Microlayer, and Underlying Water

斑马鱼在微塑料上的应用

研究对象：微纳米塑料对鱼类生殖和跨代效应的影响

持续增长的微纳米塑料（MNPs）环境污染引起人们的广泛关注。研究结果表明，MNPs具有穿越鱼类体内各种生物屏障并在其中蓄积的能力。鉴于鱼类作为人类膳食的重要来源，以及鱼类在生态系统中的关键作用，深入了解MNPs对其生殖和后代的多方面影响显得至关重要。

该研究以水生环境中大量微纳米塑料（MNPs）污染为背景，系统总结了不同种类的鱼在MNPs在单独暴露及与其他环境污染物共同暴露情况下，其生殖毒性和传代效应所受到的影响。并基于中枢神经系统与生殖健康密切相关的概念，提出利用神经行为学来快速评价生殖毒性，为评估水生环境中生殖毒性的方法提供了新的视角。

研究中，论述了MNPs对斑马鱼生殖毒性的评估指标，包括性腺生长指数、繁殖能力（如产卵量和配子质量）、性腺组织学、性激素表达测定、下丘脑-垂体-性腺轴基因表达分析。此外，还探讨了可能导致传代效应的途径，包括MNPs在配子中的积累、对配子质量的影响以及通过影响下丘脑-垂体-肾上腺轴、生长激素/胰岛素样生长因子激素水平对子代造成影响。最后，提出了结合计算机分子对接技术，在慢性、低水平、长期暴露下进一步阐明生殖传代效应分子机制的研究方向，并提出利用神经行为学来快速评价生殖毒性，为环境保护和生态健康提供更为深刻的见解。

来源：The invisible Threat: Assessing the reproductive and transgenerational impacts of micro- and nanoplastics on fish

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