负性情绪积累加速 D-gal 衰老大鼠认知衰退的神经内分泌机制研究

内容

负性情绪积累加速 D-gal 衰老大鼠认知衰退的神经内分泌机制研究

摘 要

目的：通过改进不可预知性心理应激诱导大鼠的慢性负性情绪应激，从行为 学 、 生 物化 学 、 形 态 学 等 多 角 度 观 察 慢 性 负 性 情 绪 应 激 对 D-半 乳 糖（D-galactose，D-gal）衰老大鼠认知功能的影响，初步探讨慢性负性情绪应激对 D-gal 大鼠认知功能的影响及神经内分泌机制，为老年认知功能障碍的防治提供病因学证据，并为肝主疏泄和七情内伤学说增添新认识。

方法：选用 Wistar 大鼠 70 只，雌雄各 35 只，雄鼠体重为 360±10g，雌鼠体重为 300±10g，SPF 级 3 月龄，按照旷场实验结果分为空白对照组、D-gal衰老及脑老化组（简称 D-gal 组）、慢性负性情绪应激组（简称应激组）、D-gal+慢性负性情绪应激组（简称应激 D-gal 组），每组 14 只，雌雄各半，其余为攻击鼠。采用颈背部皮下多点注射 D-gal 法（1ml/100g），对 D-gal 组和应激 D-gal组复制衰老大鼠模型，1 次/天，连续 42 天；自第 15 天起，采用改进的不可预知性心理应激方法诱导应激组和应激 D-gal 组的负性情绪（单一或复合出现的负性情绪），每天 1 种，随机出现，连续 4 周。第 37 天至 42 天采用 Morris 水迷宫法观察各组大鼠空间学习记忆能力的变化，应激前及结束后（实验第 43天）采用旷场实验法对各组大鼠进行行为学观察，并测定各组大鼠的糖水消耗量、24 小时摄食量，实验第 44 至 46 天检测各组大鼠视觉、听觉、嗅觉功能。第 47 天 取 材 并 检 测 以 下 指 标 ： ① 血 浆 激 素 水 平 ： 促 肾 上 腺 皮 质 激 素（adrenocorticotrophic hormone，ACTH）、皮质酮（corticosterone，CORT）；②血浆单胺类神经递质：5-羟色胺（5-hydroxy-tryptamine，5-HT）、去甲肾上腺素（norepinephrine，NE）、多巴胺（Dopamine，DA）；③观察大鼠大脑皮质、海马的组织形态学变化。

结果：

1 复制 D-gal 衰老及脑老化大鼠模型。

1.1 Morris 水迷宫实验：D-gal 组寻台时间较空白对照组延长（P<0.05）。

1.2 大脑皮质、海马的组织形态学变化：D-gal 组大脑皮质、海马组织形态的拟老化改变与老龄动物一致。

2 慢性负性情绪应激加速 D-gal 大鼠感官功能的衰退：嗅觉功能减退，视听觉无显著性差异。

2.1 听觉震惊实验：应激 D-gal 组听觉震惊反射采样期加速度与 D-gal 组比较，无显著性差异（P﹥0.05）。

2.2 埋藏食物小球实验：应激 D-gal 组找到食物小球时间较 D-gal 组延长（P<0.05）。

2.3 视觉悬崖实验：应激 D-gal 组视觉悬崖回避时间与 D-gal 组比较，无显著性差异（P﹥0.05）。

3 慢性负性情绪应激加速 D-gal 大鼠学习记忆能力的衰退：应激 D-gal 组Morris 水迷宫寻台时间较 D-gal 组延长（P<0.05）。

4 慢性负性情绪应激升高 D-gal 大鼠下丘脑-垂体-肾上腺（hypothalamuspituitary adrenal，HPA）轴功能相关激素：应激 D-gal 组血浆 ACTH、CORT 水平较 D-gal 组升高（P<0.05）。

5 慢性负性情绪应激引起 D-gal 大鼠血浆单胺类神经递质的变化：应激D-gal 组较 D-gal 组血浆 NE 水平、DA 水平升高、5-HT 水平下降（P<0.05）。

6 应激 D-gal 组大脑皮质、海马的组织学改变较 D-gal 组的拟老化改变加重。

结论：1 负性情绪积累是加速大鼠衰老进程中认知功能衰退的原因之一。

2 HPA 轴和交感-肾上腺髓质系统（sympathetic-adrenal medullary system，SAS）过度激活可能是慢性负性情绪积累加速大鼠衰老进程中认知功能衰退的部分作用机制。

关键词：心理应激；负性情绪；认知功能；HPA 轴

前 言

人口统计显示平均人口寿命将会持续增长，中国人口老龄化年均增长率高达 3.2%，约为总人口增长速度的 5 倍，预计到 2050 年我国老年人口比例将达到 30.4%，届时我国将成为全球人口老龄化程度最高的国家。衰老引起的认知功能下降严重危害人体健康，对社会造成沉重负担，因此如何延缓衰老，探究衰老进程中大脑认知功能下降的因素，进而改善认知成为亟待解决的问题。在以认知功能下降为主要症状的老年病中，我国老年痴呆的患病率逐年上升，药物治疗是目前痴呆治疗的主要方法，但从长远角度而言，老年痴呆防重于治。作为介于正常衰老与痴呆的中间状态，轻度认知功能障碍（mildcognitive impairment，MCI）是指患者出现记忆或认知损害，但日常生活能力无明显影响，未达到痴呆的程度。MCI 患者是痴呆的高危人群，发展成为痴呆的危险性是正常老年人的 10 倍，对 MCI 患者进行早期干预并控制危险因素，可在较大程度上降低老年痴呆的患病率。MCI 的危险因素很多，包括人口学因素、血管危险因素、遗传学因素和不良情绪等，伴随社会竞争日趋激烈，人们感受到越来越多的紧张，由此引发的情绪问题也日益增多，情绪冲突已成为多种疾病发病率升高的重要原因之一，国外报道显示经常遭受负性情绪应激的个体记忆力更易减退，我们的前期研究结果也显示，单一愤怒情绪可加速脑老化。然而，有学者对 553 例情志病患者研究发现，两种或两种以上负性情绪共同致病者占全部病例的 88.97％，即多情交织共同致病更为常见。那么，多种负性情绪长期积累对脑老化进程会产生怎样的影响，其机制如何？尚需要深入研究。中医学认为，头为诸阳之会，五脏气血皆需汇聚于脑才有神明之用，而精血的输布和运行依赖于全身气机的调畅，“气血冲和，万病不生，一有拂郁，诸病生焉”。情志不畅，肝疏泄失职，必然影响全身气机通调致使脏腑受累，或气血亏虚，脑失濡养；或痰瘀阻络，清窍阻塞；或二者兼夹，促使脑之生机下降。中医学中肝主疏泄，调畅气机，全身脏腑气血运行依赖于肝，《灵枢·天年》曰“五十岁，肝气始衰，肝叶始薄，胆汁始灭，目始不明。”其中肝在五脏中最先出现衰老征象，其疏泄功能也随之减弱，导致体内气血运行不畅，精气血无法充实脑髓，终至脑的功能受损。但肝失疏泄情志不畅加速脑老化的微观机制尚有待现代中医学研究证实。由于人群研究在伦理学和实验方法上的限制，动物实验是探讨情绪应激对衰老进程中神经行为学变化的较好替代方法，并可用于深入探究情绪应激对认知功能持续性影响的发生机制。目前情绪应激诱导方法有很多种，包括传统的束缚制动法、空瓶刺激、社交失败应激法、慢性不可预知性心理应激法等。束缚是一种纯粹的挫折应激，短时间的束缚应激可成功制作动物的焦虑模型，但随着束缚应激时程的延长，动物更多地表现出嗜睡、兴趣降低等抑郁样行为，另外由于该方法引起的躯体应激较多，且易使动物产生身体损伤；空瓶应激法所诱发情绪的重复性较差；社交失败应激法更多地考虑到动物的社会属性，是一种更加纯粹的心理应激造模方法，但需对两种动物的品系、月龄及周围环境等因素严格控制，因此模型的复制成功率较低；慢性轻度不可预知性心理应激（chronic unpredictable mild stress，CUMS）动物模型能较成功地诱发出以抑郁为主的负性情绪模型将大鼠置于电击、束缚、禁食禁水、摇晃等应激环境中，应激因子随机呈现。此种应激模型中应激因子多样化且不可预测，能避免单一刺激所引起的适应性。除此之外，该模型的可行性及重现性良好。但应激因子尚能诱发少量的躯体应激产生，若合理控制躯体应激成分，并且模拟人类在日常生活中遭遇的各种应激事件加以改进，可应用于慢性心理应激的神经生物学和行为心理学研究。另外，情绪应激动物模型的研究多建立在单一雄性动物的研究基础之上，由于动情周期所引起的雌孕激素水平的变化、生育等不可控因素，雌性动物在模型复制过程中操作相对复杂，导致雌性动物情绪应激动物模型的相关报道鲜见，然而在人类情绪障碍疾病的患病率上，男女之间存在差异，女性患情绪障碍疾病的几率显著高于男性；在应激的易感性方面，国外有报道显示女性更易遭受生活中应激事件的影响，但也有研究发现并无差异，雄性动物容易受到社会等级等社会心理因素影响，而雌性动物较少感受到，雌性动物的生理条件对较弱的应激更为敏感。基于雌雄动物的应激反应差异，以及女性的高情绪障碍罹患率，有必要将性别因素纳入情绪应激动物模型的研究设计中，以均衡性别对实验结果产生的影响。

因此，课题组对 CUMS 进行改进，采用间接电击法取代 CUMS 中的直接电击法，把间接电击法和惩罚性饮水设为慢性不可预知性心理应激的因子，结合噪声、强光等，建立并评价一个新的不可预知性心理应激的诱导方法，引入雌性大鼠，模拟人类所遭遇到的多种应激事件，从病因学的角度模拟情绪障碍疾病的环境诱因，同时采用特异性及可信性评价较高的旷场行为反应以及糖水消耗量作为评价指标，发展更有效、客观的情绪应激动物模型，为进一步深入地探讨情志疾病的发病机制作铺垫。

本项研究的主要内容如下：

1 建立更为理想的大鼠慢性负性情绪应激诱导方法，并采用适当方法评估。 

2 采用视觉悬崖实验、听觉震惊实验和埋藏食物小球实验观察慢性负性情绪应激对 D-gal 大鼠视觉、听觉、嗅觉的影响。

3 采用 Morris 水迷宫观察慢性负性情绪应激对 D-gal 大鼠空间学习记忆能力的影响。

4 检测慢性负性情绪应激对 D-gal 大鼠 HPA 轴功能的影响，包括血浆促肾上腺皮质激素(adrenocorticotrophic hormone，ACTH)、皮质酮(corticosterone，CORT)水平。

5 观察慢性负性情绪应激对 D-gal 大鼠血浆单胺类神经递质水平的影响，包括血浆去甲肾上腺素(norepinephrine，NE)、5-羟色胺(5-hydroxy-tryptamine，5-HT)、多巴胺(dopamine，DA)水平的变化。

6 观察慢性负性情绪应激对 D-gal 大鼠皮质、海马组织形态的影响。 

材料与方法

1 实验材料

1.1 实验动物

Wistar 大鼠 70 只，SPF 级 3 月龄，雌雄各 35 只，雄鼠体重为 360±10g，雌鼠体重为 300±10g，购于山东鲁抗公司（SCXK（鲁）2013-0001）。在河南省中医药研究院动物实验中心 IVC 环境动物实验室（SYXK（豫）2012-0009）进行实验，并由该实验室提供标准实验动物灭菌垫料。所有的实验过程经河南中医学院动物伦理委员会批准进行。

1.2 实验药品

D-半乳糖（美国 Amresco 公司，批号：20130806）

生理盐水（竹林众生制药厂，批号：20130915）

蔗糖（北京化学试剂公司，批号：20131106）

1.3 实验试剂

水合氯醛（250g/瓶），由北京北化精细化学品有限责任公司提供，批号：20130928，使用时配置成 10%溶液。

多聚甲醛分析纯（500g/瓶），由 Sigma 公司提供，批号：930107。用时配成 4%的多聚甲醛固定液。方法为：称取 40g 多聚甲醛粉末，置于盛有 800ml0.1mol/L PBS 溶液的三角烧瓶中，用水浴锅加热促进溶解，加热温度低于 60℃，缓慢搅拌，可加 NaOH 溶液助溶，最后用 0.1mol/L PBS 溶液定容至 1000ml，充分混匀，密封保存备用。

大鼠血浆 ACTH 酶免试剂盒（美国 R & D 公司，批号：13-12）

大鼠血浆 CORT 酶免试剂盒（美国 R & D 公司，批号：14-02）

大鼠血浆 NE 酶免试剂盒（美国 R & D 公司，批号：14-02）

大鼠血浆 5-HT 酶免试剂盒（美国 R & D 公司，批号：14-02）

大鼠血浆 DA 酶免试剂盒（美国 R & D 公司，批号：13-12）

1.4 主要仪器与设备

SK30 台式多功能高速冷冻离心机（美国 Sigma 公司）

KDC-1044 型低速离心机（科大创新股份有限公司中佳分公司）

JT601N 型电子称（上海精天电子仪器有限公司）

BS124S 型精密电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）

994 型－86℃超低温冰箱（美国热电）

PK-DS-112U 频闪仪（上海临宜电气设备有限公司）

HY-2 调速多用振荡器(江苏金坛市金城国胜实验仪器厂)

XR-XY211大鼠饮水冲突实验系统(上海欣软信息科技有限公司)

TDCG 接触式调压器（江苏金坛市环宇科学仪器厂）

XR-XZ208 大鼠震惊条件反射实验分析系统 (上海欣软信息科技有限公司)

Smart 视频图像跟踪分析系统（美国 Panlab 公司）

XR-XM101 Morris 水迷宫（上海欣软信息科技有限公司）

XR-XZ301旷场实验箱（上海欣软信息科技有限公司）

JEOL-1400 型透射电子显微镜（日本电子）

FV300 激光共聚焦显微镜（日本 Olympus 公司）

全波长自动酶标分析仪（美国热电）

Nikon 单反数码摄像机（日本尼康）

1575 自动酶标洗板机（美国热电）

HPS-250 生化培养箱（哈尔滨市东联电子技术开发有限公司）

HH.W21 电子恒温水箱（北京中兴伟业仪器有限公司）

LEICA 切片机（德国莱卡）

TL-2000MM-1 微量振荡仪（姜堰市天力医疗器械有限公司）

视觉悬崖仪（自制）

君斯达运动专用秒表（北京君斯达实业有限公司）

定时器（广州汇宝电子有限公司）

其它：烧杯、量筒、玻璃棒、止血钳、移液枪、枪头、5ml 注射器、离心

管、剪刀、刀片、手术刀柄、眼科镊、冻存管、一次性试管等。

2 实验方法

2.1 分组

Wistar 大鼠 70 只，雌雄各半，雄鼠体重为 360±10g，雌鼠体重为 300±10g，正常饲养 1 周后，按体重和旷场实验得分，剔除结果偏离大的个体，余下的大鼠采用随机数字表法分为空白对照组、D-gal 衰老及脑老化组（简称 D-gal 组）、负性情绪应激组（简称应激组）、D-gal+负性情绪应激组（简称应激 D-gal 组），每组 14 只，雌雄各半，其余作为攻击鼠。各组雌雄分笼饲养，自由饮食饮水。

2.2 衰老模型复制

参考李文彬等D-半乳糖衰老及脑老化造模方法，对 D-gal 组和应激 D-gal组复制衰老大鼠模型，具体方法：将 D-gal 粉末溶于生理盐水，配制浓度为 2%的 D-gal 溶液，并灭菌以备用。采用颈背部皮下多点注射，注射容量为 1ml/100g，1 次/天，空白对照组注射同等体积生理盐水，连续 6 周。每周测 1 次体重，根据测得体重计算注射容量。

2.3 负性情绪应激引入

改进不可预知性心理应激（CUMS）诱导方法，应激组、应激 D-gal 组分别接受 28 天八种不同的应激，每天 1 种，随机出现。

2.3.1 束缚

参考陈家旭等方法制作束缚工具：用硬塑料瓶子制作束缚筒，长为 17cm，直径为 6cm，两端为圆锥形且有圆形透气孔，筒内一端置一直径略小于瓶子内径，并可以前后调节的圆锥形塑料瓶口，可通过移动塑料瓶口调节大鼠活动空间；具体操作：将束缚筒平置于超净台上，将大鼠放进其中，束缚时间为 6 小时/天，整个束缚过程中动物在同一环境中，不予以进食进水。

2.3.2 温水游泳

将应激组和应激 D-gal 组大鼠放在盛有干净自来水且不透光的白色塑料桶(高 50 cm,直径 30cm)中，水深 30 cm，温度为(23±0.5)℃，于每天 8：00-10：00 进行强迫游泳，每次 15 分钟。

2.3.3 间接电击

采用课题组自创的间接电击法，具体操作为：使用 TDCG 接触式调压器连接特制金属笼，电压调至 36 伏，之后把应激组和应激 D-gal 组大鼠单独放入特制金属笼内，再随机放进一只攻击鼠，用一端电极触碰攻击鼠胸腹部（电极的另一端与金属笼相连以构成回路），攻击鼠受电击被激惹，对应激 D-gal 组和应激组大鼠发起攻击，双方互相对峙，产生心理应激反应和行为，频率为 1-2次/分钟，每天刺激时间为 15 分钟。

2.3.4 摇晃

将应激组同一性别大鼠放入小型鼠笼中，用绳子将其固定于 HY-2 调速多用振荡器上，振荡模式为水平往复振荡，类似摇晃，设置振荡器时间为 30 分钟，振荡频率为 160 次/分钟，引起大鼠的心理应激反应；将应激组大鼠刺激完之后，给予应激 D-gal 组大鼠刺激。

2.3.5 强光

将 PK-DS-112U 频闪仪固定于应激组和应激 D-gal 组大鼠眼睛前方 10cm处，照明频率为 300 闪光/分钟，5 小时/天。

2.3.6 潮湿垫料

每天早上 8：00 将应激组和应激 D-gal 组大鼠移出鼠笼，实验者将所在鼠笼的垫料打湿（每 100g 垫料洒入 250ml 水），混匀再将大鼠放回盛有潮湿垫料的鼠笼，晚上 20：00 将大鼠重新放入盛有干燥垫料的鼠笼，应激时间为 12 小时。 

2.3.7 噪声

采用大鼠饮水冲突试验系统的声音模块设置噪声（持续白噪音）制成录音，通过扬声器由电脑控制随机播放，扬声器距离大鼠 20-30cm，经噪声计测定噪声强度为 90dB，变化范围不超过 1dB。于早上 9：00-12：00 给予应激组和应激 D-gal 组大鼠，每天 3 小时。

2.3.8 惩罚性饮水

采用 XR-XY211 大鼠饮水冲突实验系统(上海欣软信息科技有限公司)，实验前将 4 只大鼠同时置于饮水冲突设备的鼠笼中适应 4 小时，将应激组和应激 D-gal 组大鼠先禁水 48 小时后再开始应激，应激持续 10 分钟，一旦舔吸水管口超过 20 次，就给予 2 秒电流强度为 0.5mA 的电击，电流通过饮水管金属端形成回路。每次只刺激一只大鼠，每次 10 分钟，之后继续刺激其他大鼠，实验持续时间、间隔时间、电刺激的强度均在大鼠饮水冲突试验系统中设置。

2.4 标本采集及制备

实验第 37-42 天采用 Morris 水迷宫观察各组大鼠空间学习记忆能力的变化，应激前与应激结束后（实验第 43 天）采用旷场实验法对各组大鼠进行行为学观察，并测定各组大鼠的糖水消耗量、体重及 24 小时摄食量，实验第 44-46天检测各组大鼠视觉、听觉、嗅觉功能。第 47 天取材，按照 0.3ml/100g 注射10％水合氯醛进行麻醉，麻醉后经腹主动脉取血 4-5ml，装于含 EDTA 钠的抗凝管中，静置、离心，吸取上清液，-70℃保存，用于测定血浆 ACTH、CORT、NE、5-HT、DA。然后用手术剪迅速剥离头部，置于冰块上，取出脑组织，用眼科镊沿正中矢状线分开端脑，剥离出海马，选取左侧海马用 4％多聚甲醛固定、保存，行病理检测。

3 主要观察指标及检测方法

3.1 一般状况观察

每日观察大鼠的精神状态、活动量、皮毛光泽、呼吸、摄食、粪便及对外界刺激的反应。

3.2 学习记忆能力：Morris 水迷宫在实验第 37 天下午 12：00-5：00，对各组大鼠进行 Morris 水迷宫实验，持续 6 天。

实验设备：Morris 水迷宫实验装置主要由一圆柱型水池、直径为 10cm，高28cm 的圆形黑色站台及 Smart 视频图像分析跟踪系统组成。水池高 60cm，底面直径 160cm，黑色站台没于水下 1-2cm，池壁上 4 个等距离点把水池分为 4个象限，迷宫上方装有连接电脑的摄像机，同步记录大鼠运动轨迹，采用 Smart视频分析系统进行信息采集。实验时用黑色碳素墨水将水染至黑色以更好地隐藏站台，水温控制在 22-25℃，水深超过站台 1-2cm，水池周围参照物及实验人员位置保持不变。

具体步骤：将大鼠面向池壁分别从 4 个象限的任意点放入水中，观察记录大鼠寻找站台的时间，以此反映学习记忆成绩，若 1 分钟内找不到平台，记为1 分钟，将动物放到平台上熟悉环境并休息 20 秒，随后进行下一次测试，每只大鼠每个象限测 1 次。

3.3 旷场行为学检测

在应激前和应激结束后上午 10：00-12：00，对各组大鼠进行旷场实验。实验设备：实验所使用体积 100cm×100cm×50cm 的旷场实验箱，旷场箱由不透明的黑色有机玻璃构成，箱壁及底面为不光滑面，底面用白色粉笔划分为面积相等的 25 块，沿墙格称外周格，其余为中央格，旷场箱上方装有连接电脑的摄像机，同步记录大鼠运动轨迹，采用 Smart 视频分析系统进行信息采集。

具体步骤：实验人员握住大鼠尾根部 1/3 处，小心放入旷场正中格，实验人员操作电脑，在 Smart 视频图像跟踪分析系统中记录动物 3min 的行为变化，并评分：①水平得分(Crossing)：动物穿越底面方格数为水平活动得分（四爪均进入的方格方可记数，为水平运动得分）；②垂直得分(Rearing)：直立次数为垂直活动得分（两前爪腾空或攀附墙壁，为垂直运动得分）；③旷场实验得分=①+②。同时记录中央格停留时间、修饰次数、粪便粒数。实验过程中及时用酒精擦拭大鼠运动轨迹，防止留下气味线索。

3.4 糖水消耗量测定

大鼠单笼饲养，在应激前和应激结束后对每只大鼠进行糖水消耗量实验。具体步骤：实验前训练动物适应蔗糖水，第一个 24 小时，给予每只大鼠一瓶 1%蔗糖水，第二天禁食禁水 23 小时，之后进行正式实验，即给予每只大鼠一瓶 200ml 的 l％蔗糖水，1 小时后取走并用量筒称取剩余糖水量，计算应激前后每只动物的糖水消耗量。

3.5 24 小时摄食量测定

24 小时摄食量于应激前和应激结束后测量，早上 8：00 给每笼大鼠添加饲料 200g，选择颗粒较大的饲料，防止饲料过小漏入鼠笼引起实验误差，次日 8：00 称剩余饲料量，计算 24 小时各组大鼠摄食量。

3.6 感官功能测定

3.6.1 听觉功能-听觉震惊实验(The Acoustic Startle Test)

听觉震惊反应通过大鼠对于强声音刺激的反射收缩程度来表现，大鼠反射收缩程度由系统自动记录的采样期加速度平均值来反映。采用 XR-XZ208 大鼠震惊条件反射实验分析系统给予震惊刺激并记录听觉震惊反应采样期加速度平均值，实验具体操作为：将大鼠放在一个配有声音衰减器的长方体束缚管中，在系统中设置简短的声音模块，单元内容包括 5 个 120dB 的听觉震惊反射，每个反射时间持续 60 毫秒，整个采样期加速度平均值被束缚管下的压力传感器自动记录，依据大鼠体型大小选择束缚管，实验期间，环境保持安静，禁止实验人员进出。

3.6.2 嗅觉功能-埋藏食物小球实验（The Buried Food pellet Test，BFT）

BFT 由 Nathan 等提出的经典实验改进而来。大鼠被置于一个 45 cm × 24cm × 20 cm 的无色透明测试笼中，测试笼中盛有 3cm 深的干净垫料，将与 1g大鼠饲料同等体积大小的蛋糕埋藏下垫料下方 0.5cm 处，找到食物的时间是从将大鼠放入测试笼中开始到大鼠揭开食物，并用前爪或牙齿抓住食物结束，用秒表记录这段时间，大鼠若在 5 分钟内未找到食物，则记为 5 分钟。大鼠在测试之前禁食 24 小时，每只大鼠测试结束，更换垫料防止留下气味线索。

3.6.3 视觉功能-视觉悬崖实验(Visual Cliff Test)

查阅国内外文献后自制仪器，视觉悬崖仪由 90cm×80cm×72cm 钢化玻璃组成，上下无玻璃覆盖，在距离仪器上端 30cm 固定一水平玻璃板（90cm×72cm），在距离仪器右端 30cm 固定一垂直玻璃板（72cm×50cm），在右侧水平玻璃板和垂直玻璃板的内侧覆盖上单位直径为 2cm 黑白棋盘方格图案，同时在右侧水平玻璃板的下方（仪器底部）也铺上黑白棋盘方格图案，水平玻璃板与垂直玻璃板的交界处制作出悬崖的视觉效果，但实际上并没有危险性。实验具体操作为：将大鼠置于玻璃板上，使前爪和背部延伸到悬崖处，记录大鼠从放置悬崖时到身体返回或越过悬崖的时间，如果大鼠在 60 秒内没有任何反应或越过悬崖，记为 60 秒。考虑到大鼠在前进过程中易受触须的引导，实验前将大鼠触须剪掉，实验过程中中间的水平玻璃板保持透明洁净，无杂物痕迹干扰视觉效果，每只大鼠测试完，用酒精擦拭其运动轨迹，防止残留气味线索。三个测试分别在三天进行，以减少在同一天进行产生的携带效应。

3.7 血浆促肾上腺皮质激素（ACTH）、皮质酮(CORT) 、去甲肾上腺素(NE)、五羟色胺(5-HT)、多巴胺（DA）水平测定方法：酶联免疫吸附法

步骤：

①将血浆标本从-70℃冰箱中取出，置于冰块上缓慢融化；

②从冰箱中取出试剂盒，平衡至室温(20-25℃)；

③在酶标包被板上设标准孔 10 孔，空白孔 2 孔，其余为待测样品孔； 

④按照试剂盒说明逐级加入稀释过的标准品 100µ1；

⑤在酶标包被板上加入稀释过的血浆 ACTH50µ1，将样品加于酶标板底部；

⑥温育：用封板膜封板后置 37℃生化培养箱中温育反应 30 分钟；

⑦洗涤：小心揭掉封板膜，置于洗板机上洗涤 5 次，每次静置 10-20 秒；

⑧加抗体：每空加亲和链酶素-HRP50µ1，空白孔除外；

⑨温育：同⑥；

⑩洗涤：同⑦；

每孔加入底物 A、B 液各 50µ1；

37℃下避光温育反应 15 分钟；

每孔加入 50µ1 终止液。轻轻混匀 30 秒，15 分钟内在 450nm 波长处读取OD 值。以标准品 OD 值为纵坐标，以标准品的浓度为横坐标，绘制标准曲线，CORT、 NE、 5-HT、 DA 水平测定同上，生成标准品的回归方程（ ACTH：y=0.0089+21.296x，R2=0.9878；CORT：y=-3.6626+161.81x，R2=0.9998；NE：y=-5.2902+63.344x，R2=0.998；5-HT：y=-2.3395+68.923x，R2=0.9991；DA：y=2.6904+27.968x，R2=0.996）。

3.8 大脑皮质、海马形态学的检测

取出固定于 4%的多聚甲醛中的大脑组织标本，切取矢状面，平铺于包埋盒中固定 24 小时后，流水冲洗，乙醇逐级脱水，石蜡包埋，切片 3µm 厚，HE染色，光学显微镜下观察大脑皮质及海马形态。

4 统计学方法

4.1 统计分析软件

应用 SPSS13.0 统计分析软件对数据进行统计分析。

4.2 统计分析方法

4.2.1 检验水准：所有的统计检验均采用双侧检验，显著水平 α=0.05。

4.2.2 统计描述：数值变量资料采用x ±s进行统计描述。

4.2.3 假设检验：数值变量资料多组间均数差异的比较，服从正态分布的资料采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)，组间两两比较，方差齐的资料采用 LSD检验，方差不齐的资料采用 Dunnett T3 检验。

4.2.4 参数估计：采用 95％可信区间对统计量进行参数估计。 

讨 论

1 负性情绪

1.1 中医学对情志的认识

中医情志学说的核心是七情太过与不及而致病。七情，是指喜、怒、忧、思、悲、恐、惊七种正常的情志活动，是人体由于内外界环境变化产生的生理和心理上的反应，但中医学尚少对情志进行极性分类，韩成仁认为七情有正负两性情志效应，喜属正性情志，怒、忧、悲、恐、惊对身心作用弊大于利，归属负性情志，思无明显极性。正常的情志活动可使人体气血和顺，促进机体健康；但七情太过或不及可损伤脏腑、耗竭精气，加速人体衰老。《灵枢•百病始生》曰：“喜怒不节则伤脏。”《素问·阴阳应象大论》说：“暴怒伤阴，暴喜伤阳。”可见情志过极可直接损伤脏腑精气从而损耗脏腑阴阳；再者七情太过导致脏腑气机升降失常，影响全身气血输布，久之脏腑功能下降。《素问•举痛论》云：“百病生于气也，怒则气上，喜则气缓，悲则气消，恐则气下。”“气血冲和，万病不生，一有拂郁，诸病生焉”。 肝主疏泄，调畅气机，若情志过极，超出了肝的调节限度易引起肝失疏泄，气血运行不畅，造成气滞血瘀，脏腑精血无法养神，神明不能内守，出现精神抑郁或急躁等症状。

1.2 心理学对负性情绪的认识

情绪心理学上常依据效价（效价是指与特定生理或心理状态相关的正性或负性负荷）将情绪分类为正、负两极，位于正极的称为积极情绪，通常带来愉悦感受，反之，位于负极的为消极情绪，产生不愉悦感受。孟昭兰认为，负性情绪是具有负性效价的情绪。它可反映个体主观紧张体验与不愉快投入，包括愤怒、恐惧等一系列令人厌恶的情绪体验。

拉扎勒斯认为情绪是通过认知评价决定和完成的。情绪的产生源自于人与环境之间的相互关系，当个体察觉或估价一种有威胁的情景之时，随即会将这种环境评价为应激，个体面对该应激时产生不同种类及强度的情绪反应，如焦虑、抑郁、愤怒等。这些应激负性情绪反应的产生是基于应激源的种类、性质、持续时间等的，那些负性生活事件应激、不可控制的或生活核心部分事件更易引起人们的负性情绪反应。

1.3 慢性负性情绪应激与肝郁证

当外界刺激作用于机体时，机体会进行自身的调节平衡，但持续、突然、过强的外界刺激会引起肝疏泄不及，而肝主疏泄，调畅气血，情志的产生依赖于脏腑气血的盛衰，若肝疏泄失常则会造成情志不畅，持续长期积累，最终处于肝气郁结状态。在情绪心理学中，抑郁是一种复杂的复合情绪，或合并诱发愤怒、悲伤、痛苦等情绪，它比任何单一负性情绪的体验都更为强烈、持久。拉扎勒斯分析认为个体陷入多种负性情绪交织缠绕的状况下，不能正确地认识自己与他人的关系，则会产生一系列适应不良的社会行为，最终形成压抑、郁闷状态。现代医学研究认为负性生活事件若超出人们的控制，可使人们产生无助感和失控感，从而诱发抑郁症。国外有研究报道显示，有暴力和幼年虐待经历会增加人们产生抑郁症状的风险，负性应激事件与不良的健康状况相关。这与中医由情志不畅所引起的肝郁证有相通之处，两者共同阐述了在遭遇持续不良心理应激时，个体内部的心理及生理状态发生变化，并最终累积形成肝气郁结状态的过程。

1.4 抑郁与其他情绪共病

国外有文献报道，焦虑障碍是抑郁症首发的危险因素，很多研究证实了焦虑与抑郁障碍存在显著的高共病率，Hettema JM等建立了相关假设，认为焦虑与抑郁障碍这种关系的潜在基础是共享遗传基因；有些研究认为是个性特征中的抑郁和焦虑易感性遗传变异造成了这种高共病率现象，多种情绪交织已成为精神障碍疾病患者的共同状态。任何负性情绪体验交织在心中长期积累并互相影响，最终会使机体处于压抑、抑郁状态中。因此，抑郁比其他情绪都更为强烈持久。

2 认知功能

2.1 中医对认知功能的认识

《类证治裁·卷三》记载：“脑为元神之府，精髓之海，实记忆所凭也”。《医林改错·脑髓说》云：“灵机记性不在心在脑”，说明脑与记忆能力密切相关，同时脑协调运动和感觉功能，正如《医学原始》云：“脑颅居百体之首，为五官四司所赖，以摄百肢，为运动、知觉之德。”“年高无记忆者，脑髓渐空”，这些医家论述指出随着年龄增长，记忆与脑髓容量呈正相关性。倘若脑失濡养，脑髓失去生化之源，清窍蒙蔽；或痰瘀阻络，脑髓乏清阳之助，津液之濡，则清窍不灵、元神失聪，终可致脑之生机下降。脑为神明之府，然而脑主神明作用的发挥，需脏腑气血精华提供养分，而精血清阳之气的输布和运行依赖于全身气机的调畅。情志不畅，肝疏泄失职，必然气机郁于经络，气血精华不能汇聚至脑，从而失去濡养；或血瘀痰阻闭塞脑络，神机失统，导致愚傻、呆笨等痴呆表现。《千金翼方·养老大例第三论》记载：“人年五十以上，阳气日衰，损与日至，心力渐退，忘前失后、兴居怠惰，计授皆不称心，视听不稳，心无聊赖，健忘嗔怒。”其中关于视觉、听觉感官功能的记载提示了老年痴呆等脑退行性疾病中感觉功能下降是脑功能损伤的一个反映。

2.2 现代医学对认知功能的认识

认知功能是人脑接受外界各种信息，并进行加工将其转化为内在知识的能力。具体由多个认知域构成，包括视空间、注意力、记忆、计算、分析、判断、执行能力等。认知是指个体获得认识或应用知识过程，它包括感觉、知觉、记忆、思维和语言等。认知过程开始于感觉和知觉，而知觉是对事物的整体及其之间的联系的认识，人通过感知觉获得的知识经验在大脑的整合作用下积累和保存下来，这个过程称为记忆。负性情绪可干扰视觉、听觉、嗅觉等感觉功能，降低大脑对外界信息的加工效果，并影响记忆等更高级认知功能的实现。

2.3 衰老与认知功能衰退的关系

一般认为，衰老是生物体随增龄发生的全身形态结构与生理功能的退行性变化，是受遗传因素影响的渐进过程，可分为生理性衰老和病理性衰老，生理性衰老主要表现为身体系统功能的衰退性改变，如视觉、听觉、嗅觉敏感度随年龄增长逐渐降低。神经系统老化的主要表现为认知功能下降。病理性衰老则是由于压力、疾病等作用，机体的正常衰老速度加快的现象，在病理性衰老过程中，作为身体的中枢，大脑的退化也较自然衰老加快，认知功能减退是脑老化的重要标志，是痴呆等疾病的突出表现，MCI 是指患者出现记忆或认知损害，但日常生活能力无明显影响，未达到痴呆的程度，是介于正常衰老和痴呆的中间状态，MCI 患者是痴呆的高危人群，发展成为痴呆的危险性是正常老年人的10 倍，是进行药物干预治疗的最佳阶段。

MCI 的危险因素有高龄、遗传、环境、不良情绪等，伴随社会竞争日趋激烈，人们感受到越来越多的紧张，由此引发的情绪问题也日益增多，在引起衰老、导致疾病的过程中起重要作用，国外报道显示经常遭受负性情绪应激的个体记忆力更易减退，我们的前期研究结果也显示，单一愤怒情绪可加速脑老化，然而，有学者对 553 例情志病患者研究发现，两种或两种以上负性情绪共同致病者占全部病例的 88.97％，即多情交织共同致病更为常见。那么，多种负性情绪长期积累对脑老化进程会产生怎样的影响，其机制如何？尚需要深入研究。

3 中医负性情志对脑的影响

朱丹溪在《丹溪心法·六郁》中指出：“气血冲和，百病不生，一有拂郁，诸病生焉”；清·陈士铎《辨证录》明确提出痴呆病“始于肝郁”；《景岳全书》亦云：“痴呆证，凡平素无痰，而或以郁结，或以不遂……而渐致痴呆。”可见情志失调、气机郁结在痴呆发病中的重要性。有学者认为痴呆等脑老化疾病的病因多为情志失调，肝失疏泄，肝气郁滞，而致痰、湿、瘀蒙蔽清窍，终至心脑失养。对于中医负性情志对脑的影响，现代中医学者也做了较多研究。方倩等对肝郁脾虚型抑郁症患者的认知功能进行神经心理学评估，发现肝郁脾虚型抑郁症患者的信息加工能力、注意力、短时记忆力较非肝郁脾虚型更差，吴正治研究柴胡疏肝散对 Aβ1-40诱导的肝郁证阿尔茨海默病大鼠海马神经递质的变化，结果显示柴胡疏肝散可以通过调节 NE、DA 和 5-HT 的水平，提高实验大鼠的记忆和学习能力，他们还发现疏肝解郁法可通过阻断内质网应激细胞凋亡信号通路，明显抑制痴呆模型大鼠的神经细胞凋亡；也有学者发现疏肝解郁法能减少 D-gal 小鼠脑组织中自由基水平、抑制脑细胞凋亡、改善突触可塑性，延缓脑的衰老。刘子旺等观察肝气郁结证患者和正常受试者的功能性磁共振成像(functional magnetic resonance imaging，fMRI)，提示肝气郁结证患者参与工作记忆的脑区明显减少，其改变主要在左侧额叶和顶叶，这为进一步通过脑成像技术直观定位分析负性情志对脑部功能的影响提供了一个新的视角。

4 负性情绪积累对老年人认知功能的影响

4.1 负性情绪积累对老年人记忆的影响Kindermann SS 等

通过对 25 例未患痴呆的老年抑郁患者调查发现，患者组的 P300 潜伏期较对照组有显著的延长，该现象预示着患者组在执行功能任务中的较差表现。Gabryelewicz 等对 105 名 MCI 患者进行三年的队列研究发现，有抑郁症状的老年人更易从 MCI 发展为阿尔兹海默病（Alzheimer's disease，AD）。Fernández Martínez M 等采用病例对照方法对西班牙地区的痴呆患者及正常人进行研究，得出抑郁症可能是 AD 和血管性痴呆（Vascular Dementia，VD）的独立危险因素，这些研究均显示抑郁、焦虑等负性情绪可加速认知功能减退，并已成为痴呆等老年认知相关疾病的危险因素。

4.2 负性情绪积累对老年人感官功能的影响

新近的国外文献采用嗅觉敏感度、气味识别和辨别方法对健康个体和抑郁症患者的嗅知觉进行研究，结果证实抑郁症与嗅觉敏感性下降相关，当健康个体处于抑郁状态时，相似的过程也会发生，这些结果提示负性情绪积累可加速人体嗅觉功能的衰退，但对于负性情绪对视觉、听觉功能的影响尚鲜见报道。

达尔文早期从系统发生的观点对动物行为进行了比较研究，揭示出不同种的动物在行为模式上的相似性。即高等动物的行为成分和功能特征，也能在较低等动物身上找到。在一些简单的感觉、记忆功能方面，人类与其他物种存在相似性，因此，动物认知研究通常使用各种条件化程序，反映人与其他物种的许多共同的认知过程（如感觉、记忆等）。

5.1 慢性负性情绪应激对 D-gal 大鼠感觉功能的影响

视觉、听觉等感觉功能是机体高级、复杂认知活动的前提，人类及动物通过视、听、嗅等感官功能获取周围的环境信息，认识事物的个别属性，并对相关信息进行加工整合形成记忆等高级认知功能，我们推测老年人的感觉知觉功能下降或许是老年人认知功能障碍发生的必要条件。视觉定位法可用于判断动物的视觉。实验者抓住动物的尾巴，将其提到离桌面上方 15cm 处，并缓慢将其放到桌面上，如果动物视觉功能正常，通常会伸展前爪，该法能定性判断动物视觉有无。视觉悬崖实验是较为常用的测量总体视觉能力的方法，最初用于研究婴儿的视觉深度，是发展心理学的经典实验之一。实验中我们采用透明玻璃板和黑白棋盘格图案制造一种“视觉悬崖”的错觉，通过记录大鼠看到悬崖并回避到安全区域的时间客观评估大鼠的视觉功能。

听觉震惊反射为测量大体听觉能力提供了一个很好的方法，在该实验中，面对突然提高的声音，人类表现为眨眼反射，动物则为身体的急剧收缩反应，可通过测量眨眼反射程度和身体收缩幅度评价听觉能力，听觉能力与大鼠的身体收缩幅度呈反比。

埋藏小球实验是目前检测嗅觉功能的经典方法，找到埋藏食物所用的时间，可作为嗅觉能力的量度指数。林静等采用此实验对小鼠嗅觉功能进行评估，以 300 秒作为嗅觉障碍的临界值，嗅觉正常的大鼠在 300 秒内均能找到食物。由于大鼠饲料与垫料气味接近，实验前期我们的结果不理想，后期实验中采用气味较浓的蛋糕代替大鼠饲料，达到较好效果。

我们的实验结果比较显示，应激 D-gal 组听觉震惊反射采样期加速度及视觉悬崖回避时间较 D-gal 组无显著差异；应激 D-gal 组较 D-gal 组大鼠找到食物小球时间减少，提示遭受过负性情绪应激的 D-gal 衰老大鼠，嗅觉功能损害更甚，视听觉与嗅觉功能结果的不一致可能是由在两种原因：一是大鼠是一种嗅觉动物，它们主要通过嗅觉感受器感受外部世界的化学物质作出各种生存选择，嗅觉能力与觅食、学习记忆等行为高度相关，是大鼠日常活动中使用最频繁的感官功能，因此更易受损；二是大鼠的感觉功能及敏感度随着增龄不断下降，不同感觉系统的发育、衰退程度不等以致它们之间的个体差异偏大。实验大鼠5 慢性负性情绪应激对 D-gal 大鼠认知功能的影响的体重、月龄、品系虽一致，但神经系统的发育程度可能不同，这就提示我们在造模之前须对大鼠进行简单的感觉系统功能的评估以保证样本的同质性。

5.2 慢性负性情绪应激对 D-gal 大鼠学习记忆的影响

D-gal 衰老模型中，实验者在一定的时间内连续注射一定浓度的 D-gal 溶液，在细胞内醛糖还原酶的作用下，增多的半乳糖还原为半乳糖醇，后者不能进一步代谢，从而在细胞内大量积累，引起细胞肿胀、渗透压改变，最终导致代谢障碍、神经系统退行性病变。实验结果中应激 D-gal 组旷场实验中央格停留时间较 D-gal 组延长，提示长期负性情绪应激使 D-gal 组大鼠的认知能力下降。Morris 水迷宫是目前研究啮齿类动物的学习记忆最常用的评估工具之一，这是一种空间导航实验，动物的求生本能促使其在水池中游泳，直至找到水面下的平台为止，在此过程中，动物被训练以水池周围物体的位置为空间标识寻找平台，并重复学习形成记忆。在老年痴呆等认知减退疾病中，采用“平均逃避潜伏期”（即动物从放入水中到找到平台上的时间）评价动物的空间学习记忆能力最为频繁。

实验结果显示，与空白对照组相比，应激组、D-gal 组、应激 D-gal 组大鼠寻台时间明显延长；提示应激对正常和 D-gal 衰老大鼠的学习记忆均产生了不良影响，与应激组和 D-gal 组相比，应激 D-gal 组大鼠寻台时间明显延长，结果表明长期负性情绪应激干扰了 D-gal 组大鼠对空间信息的加工，加重了 D-gal 组大鼠的学习记忆损害。大脑皮质、海马的组织形态学变化显示，D-gal 大鼠的大脑皮质、海马的组织形态学呈现出老龄动物的变化。参考大鼠的行为学及组织形态学结果，可以认为 D-gal 衰老大鼠建立成功。

旷场实验中的中央格停留时间延长、嗅觉功能下降及水迷宫的寻台时间明显延长,从不同侧面说明了负性情绪应激可使 D-gal 大鼠的整体认知功能认知功能下降。

6 慢性负性情绪应激对 D-gal 大鼠认知功能的神经内分泌机制探讨

6.1 慢性负性情绪应激对 D-gal 大鼠 HPA 轴的影响

应激反应是指在应激源的刺激下，个体所产生的生理、心理及行为反应。在日常生活中，应激源多种多样，如社会环境、生活事件、自然灾害等。当各种应激源作用于人体时，机体会产生一系列以 HPA 轴为核心的神经内分泌反应，参与其中的激素包括促肾上腺皮质激素释放激素(corticotropin-releasinghormone，CRH)、促肾上腺皮质激素(ACTH)和糖皮质激素（glucocorticosteroid，GC）。HPA 轴激活，下丘脑释放的 CRH 升高，CRH 的高分泌促进了垂体 ACTH水平的上升，后者又作用于肾上腺皮质，引起 GC 水平升高，应激学说与中医七情理论接近，长期应激导致抑郁可能是通过 HPA 轴功能持续亢进，皮质醇升高并激动糖皮质激素受体，最终破坏海马神经细胞，导致海马体积缩小而发生的。国外大量研究证实，与健康对照组相比，抑郁症患者也出现HPA 轴亢进的生物学变化，HPA 轴的激活促进抑郁症患者早晨和晚上的唾液皮质醇水平升高，抑郁作为痴呆等老年疾病的高危因素，可能是通过 HPA 轴亢进作用于人体引起的，国内中医证候动物实验也显示相似结果。

持续升高的 GC 以及随之产生的兴奋性氨基酸可引起海马的树突萎缩和神经元损伤，这些可能会使海马的功能丧失，也有报道发现阻断糖皮质激素受体（glucocorticoid receptor，GR）可以逆转慢性应激对突触结构和功能的损害，同时防止 GC 所引起的神经再生的减少，在 AD 患者中，HPA 轴被过度激活，HPA 轴亢进所引起的认知衰退可能是由于持续高水平的 GC 所导致的神经元退化、缺失的结果。海马的 GR 表达最高，对应激反应非常敏感且极易受损，海马在降低应激状态下 HPA 轴的异常兴奋性的同时，也参与学习记忆过程，因此海马与应激、记忆密切相关。检测结果显示，应激 D-gal 组大鼠血浆 ACTH、CORT 水平较 D-gal 组增加，这提示慢性不可预知性应激提高了 D-gal 衰老大鼠的 HPA 轴的兴奋性，促使应激 D-gal 组大鼠的血浆 ACTH 及 CORT 水平升高，与文献报道一致。

6.2 慢性负性情绪应激对 D-gal 大鼠单胺类神经递质水平的影响

中枢单胺类神经递质包括去甲肾上腺素（NE），5-羟色胺（5-HT），多巴胺(DA)。三类神经递质参与不同的系统，它们之间相互制约，相互协调以维持机体正常的情绪活动和记忆功能，在一定程度上血浆中单胺类神经递质的改变可以反映中枢单胺类神经递质的浓度变化。NE 能神经元主要集中在蓝斑核，上行纤维投射到新皮质、边缘系统和杏仁核，NE 维持全脑的觉醒状态，与应激时情绪反应相关，是交感-肾上腺-髓质激活的主要指标，血浆 NE 浓度可反映外周交感神经的功能。5-HT 能神经元主要集中于低位脑干的中缝核内，参与调节睡眠、情绪、记忆等行为。5-HT 是由体外摄入的色氨酸作为前提物质合成的，合成过程受到色氨酸羟化酶和 5-HTP 脱羧酶的限速作用。当机体受到各种心理应激时，大脑5-HT 的合成和代谢产生变化，大量不同的受体系统相互协调介导 5-HT 参与情绪的抑制控制过程，因此 5-HT 及其受体功能失调与抑郁等精神疾患相关。

DA 能神经元主要位于中脑，参与调控运动、动机与奖赏、内分泌等过程。DA 是 NE 合成的前体，由体外摄入的酪氨酸作为前提物质在酪氨酸羟化酶、多巴脱羧酶的作用下合成，DA 能系统更多地涉及愉悦等正性心理过程，传递愉悦、兴奋等信息，DA 通过激活 DA 受体对突触传递发挥缓慢作用。 

中枢单胺能系统功能下降是抑郁症的重要假说之一，该假说认为中枢神经系统突触间隙单胺类神经递质浓度水平或功能下降，是抑郁障碍的生物学基础，崔宁等采用病例对照研究对 200 例不同证候的老年抑郁症患者进行研究发现，老年抑郁症患者 NE、5-HT、DA 普遍降低。实验结果中，应激 D-gal 组比D-gal 组血浆 NE 水平明显上升可能是因为负性情绪应激状态下，D-gal 大鼠 SAS的激活使体内 NE 大量释放入血，该结论印证了徐志伟等的研究结果；应激D-gal 组大鼠血浆 5-HT 水平较 D-gal 组明显下降，提示负性情绪应激促进 D-gal大鼠血浆 5-HT 水平下降，这一结果与崔宁在老年抑郁症人群中调查结果接近。

7 负性情绪应激对 D-gal 大鼠皮质、海马组织形态学的影响

大脑是人体的高级调节中枢，认知功能是由大脑神经元和神经纤维的信息传递作用介导完成的，因此大脑高级功能的实现依赖于大量的神经元，集中于大脑皮层，神经元通过突触联系形成复杂的神经网络。大脑皮质随年龄逐渐变薄，国外有报道证实，同年龄匹配的 MCI 患者较正常老年人存在明显的海马萎缩，疑似阿尔兹海默病患者的海马以及相邻颞叶较 MCI 患者萎缩更甚。海马位于颞叶内侧面的基底部，是边缘系统的主要组成部分，在冠状面上呈 C 字形，与齿状回相连,共同形成 S 形的结构，从 C 字始端依次分为 CA1、CA2、CA3、CA4 区。伴随衰老，海马 CA1 区神经元逐渐减少，细胞学研究表明，CA1区对缺氧、应激等损伤最为敏感，也被称为易损区。

我们的实验发现应激 D-gal 组较 D-gal 组大脑皮质厚度明显变薄，神经细胞数量减少，细胞周围可见空泡形成，皮质血管分布稀疏、数量减少；海马 CA1区神经细胞数目减少，排列稍松散，部分神经元形态皱缩，细胞间距较大，伴胶质细胞增生，提示负性情绪引起 D-gal 大鼠大脑神经元结构退化性改变。由于脑组织结构破坏，神经元的数量减少，神经元信息传递受阻，学习记忆功能随之下降。

7 慢性负性情绪应激诱导方法的改进

动物实验有材料较易获得，涉及的伦理道德问题相对较少等优势，且能够从宏观到微观层次对疾病发生机制进行深入研究，因此，依据肝郁证的病因原理，现代很多医家制作了肝郁证的动物模型。有不少学者采用束缚制作肝郁模型，但束缚应激本身会产生躯体应激甚至损伤，居住入侵（社交失败）造模方法通过建立动物之间短暂的不良社会关系，诱发动物的负性情绪心理反应及行为。魏盛等采用居住入侵法建立经前期综合征肝气郁证大鼠模型，并与慢性束缚应激模型比较，发现两种造模方法的行为学评价效果无显著差异，均出现肝气郁证的症状，居住入侵法的制作原理更接近临床肝郁证的发病原因，但模型复制成功率低。上述应激方法多为单一应激方式持续作用于动物，在我们的实验中发现，同一种刺激方式可使动物能预测到下一个刺激的产生并逃避，减弱应激模型复制效果，应激因子的不可预测性是动物逃避反应缺失的关键。

CUMS 动物模型能较成功地诱发出以抑郁为主的负性情绪，应激因子多样化且不可预测，能避免单一刺激所引起的适应性，可应用于慢性心理应激的神经生物学和行为心理学研究。CUMS 模型将大鼠置于电击、束缚、禁食禁水、摇晃等应激环境中，应激因子随机呈现，从病因学的角度模拟了抑郁症的环境诱因，但其中的电击、禁水禁食对动物产生躯体应激，因此，我们筛选出间接电击、惩罚性饮水、噪声、强光、摇晃、潮湿垫料、温水游泳和束缚八种应激因子，建立一个新的不可预知性心理应激的诱导方法，每种应激方式最大限度地减少了躯体应激成分，产生的心理应激反应相对纯粹。预实验的动物造模反应显示，大鼠在八种应激作用下，均不同程度地产生对环境的排斥及厌恶感，例如采用噪音刺激时，大鼠低头并将身体蜷缩企图减少噪音干扰，很少进行修饰及其他活动；频繁光照刺激时，大鼠将身体转向光源的对侧，行动减少。28天的造模之后，大鼠在旷场实验中的得分和糖水消耗量明显下降，基于这些研究基础，仍采用这八种应激因子。

应激时间的长短可使模型所产生的情绪反应类型不同，这在 CUMS 模型中体现为单一应激因子的作用时间和总体应激持续的天数，我们在预实验中观察了连续 2-6 小时束缚应激对大鼠产生的影响，在 2-3 小时阶段，束缚大鼠抓挠瓶壁、挣扎，甚至啃咬瓶子的透气孔以脱离束缚；在 4-5 小时阶段，大鼠的挣扎及抓挠瓶壁次数减少，仍有啃咬瓶子的情况发生，偶尔有修饰；在 6 小时阶段，大鼠渐不挣扎，无活动及修饰，也有文献报道证实，短时间的应激条件下动物产生的反应以焦虑为主，长时间的应激作用会使动物的抑郁成分显著增加，本实验目的旨在研究长期负性情绪应激对 D-gal 大鼠的影响，因此在诱导方法的改进方面侧重于将单一应激因子的作用时间适当延长。对于应激动物的选择，雄性动物容易受到社会等级等社会心理因素影响，而雌性动物较少感受到，雌性动物的生理条件使其对较弱的应激更为敏感，因此，基于雌雄动物的应激反应差异以及女性的高情绪障碍罹患率，有必要将性别因素纳入情绪应激动物模型的研究设计中，以均衡性别对实验结果产生的影响。

8 慢性负性情绪应激诱导方法的评价

在慢性负性情绪应激诱导方法的评价上，行为抑制和快感缺失的水平是衡量造模动物抑郁程度的可靠指标，旷场实验是评价啮齿类动物运动功能及探究趋势的行为学测试方法，可用来判断动物是否处于应激状态以及行为抑制的程度。该测试的指标中，水平得分即动物穿格数，反映动物的兴奋性；垂直得分即动物站立次数，主要反映动物对周围环境的不确定性和探究趋势；修饰次数与动物对环境的满意程度呈正相关；粪便粒数与动物的紧张程度呈正比；中央格停留时间反映动物对环境的认知能力，随着停留时间延长，认知功能降低。糖水消耗实验是 Willner 发明的用于评价 CUMS 模型的快感缺失程度。另外抑郁患者也多有食欲下降、体重减轻症状，因此在评价中也将大鼠 24 小时摄食量计入在内。

各组大鼠旷场实验的结果显示，应激组旷场实验水平得分、垂直得分及总得分较空白对照组下降；提示慢性负性情绪应激降低了大鼠的兴奋性和探究趋势，活动量减少。各组大鼠糖水消耗实验的结果显示，应激组糖水消耗量较空白对照组减少，这与任利翔等的研究结果一致，大鼠有嗜甜食的习惯，糖水消耗量下降反映出大鼠的“快感缺失”状态，这与人类在负性情绪状态下，对通常令人感到愉悦的事物缺乏愉快的情绪反应相似。

各组大鼠 24 小时摄食量的结果显示，应激组 24 小时摄食量较空白对照组减少，这与人类在负性情绪状态时所表现的食欲下降等症状相符，该现象可能为大鼠受到各种应激因子作用，作息规律紊乱所致。根据荷兰 K.Mortom 教授和美国 J.Irwin 专家对大鼠表情行为的描述：活动减少，扎堆和细声叫为抑郁表现；眼神呆滞和胡须下垂则为抑郁表情。应激前期，我们观察到应激组大鼠精神紧张，毛发竖立，尖叫，个别大鼠与同伴打斗、撕咬，随着应激时间的延长，大鼠毛发零乱，目光无神，笼内大鼠紧挨，头部蜷缩于身体中，饮水及摄食量明显减少，夜间时有细声尖叫，由观察到的大鼠的表观行为结合旷场实验、糖水消耗实验的定量指标证实，将大鼠的行为表现判定为抑郁状态是准确的。

9 本研究的不足之处

本实验慢性不可预知性心理应激方法造模过程中，虽然采用间接电击代替直接电击，但在对峙打斗过程中，应激 D-gal 组和应激组大鼠的前爪仍不可避免地接触到攻击鼠的身体，电流可通过后者传递到前两者；另外游泳对于大鼠来说，也是一种较为强烈的应激因子，该过程中动物依靠前爪力量攀爬桶壁，并期望挣扎浮出水面，身体产生一定的生理应激成分，因此，模型制作可能仍然夹杂有部分躯体应激，需采用更加合理的方法加以控制。

另外，对于 D-gal 大鼠的衰老模型评价中，仅有行为学和形态学指标的支持，缺乏微观生化指标的证据，可检测外周血单核细胞端粒酶长度和端粒酶活性以增强模型评价的说服力。

最后，对于慢性负性情绪应激加速 D-gal 大鼠认知功能减退的机制，我们只进行了神经内分泌方面的研究，推测慢性负性情绪应激是通过神经内分泌激素的改变引发认知功能损害的，但具体这些神经内分泌激素是如何与细胞表面受体结合，通过何种通路影响海马结构与作用，从而引起大脑认知功能下降的，并未分析，尚有待进一步深入研究。 

结 论

1 负性情绪积累是加速大鼠衰老进程中认知功能衰退的原因之一。

2 HPA 轴和 SAS 过度激活可能是慢性负性情绪积累加速大鼠衰老进程中认知功能衰退的部分作用机制。 

 

对情绪应激造模方法的若干思考

摘要：抑郁、焦虑等负性情绪在日常生活事件中表现得越来越常见，负性情绪应激与疾病的关系已成为当前医学和心理学的研究热点，情绪的主观性和复杂性使情绪应激动物模型的制备和评估存在较大难度，本文对近几年常用的情绪应激动物模型进行简要综述，以优化实验设计、制作有效的情绪应激动物模型，为今后探讨人类情绪障碍疾病的起因和发病机制做铺垫。

关键词：情绪应激；动物造模；行为学

抑郁、焦虑等负性情绪在日常生活事件中表现得越来越常见，研究表明，在长期遭受负性情绪刺激的人群中，抑郁症等精神疾患及脑老化的发病率上升,深入探讨负性情绪应激在致病过程中的作用机制，具有重要的研究意义和实用价值。由于伦理学的限制，动物实验是较为理想的研究疾病发生机制的方法。但情绪的主观性和复杂性使情绪动物模型的制备和评估存在较大难度，本文对近几年常用的情绪应激动物模型进行简要综述。

1 社会应激法

传统的情绪应激动物模型将动物置于一系列不可逃避的物理或化学应激环境中，然而该类造模方法通过建立动物之间短暂的不良社会关系，从而诱发动物的负性情绪心理反应及行为，更多地考虑到动物的社会属性，是一种更加纯粹的心理应激造模方法，但模型的复制成功率较低，需对两种动物的品系、月龄及周围环境等因素严格控制。

1.1 社交失败模型

社会失败模型(Social Defeat)最早是 KazunoriMine 等人在 1981 年设计的, 实验者将一批雄性大鼠单独饲养以诱发其攻击行为倾向。一旦另一受试动物进入笼内, 就会受到大鼠的猛烈攻击。但我们采用其描述方法复制实验效果并不理想，新近研究表明，不同品系的动物在社交失败应激中反应有差异。王静等采用树鼩建立社会竞争失败病因学模型，持续 21 天。其中争斗失败者被称为服从者，表现出逃跑、恐惧、顺从等从属性特征。这个过程可导致每天 1 h 的直接社交冲突和 23 h 的间接相互影响(比如通过气味、视觉等)。与正常对照相比,失败者 21 天之后显示了体重、自主活动、躲避行为、尿液皮质醇水平等的变化,并且这种改变可持续至少 2 周以上。董竞成等将攻击性 CD-1 小鼠与C57 小鼠放于同一环境中建立小鼠社交失败模型并分析该模型的行为学变化特征。结果显示应激组 C57 小鼠在角落区域的停留时间延长，而在社交区域的停留轨迹明显减少。2005 年德国哥廷根大学选用性情凶猛、攻击性强的 Lister Hooded雄鼠攻击 Wista 雄鼠，成功制备出与临床表现吻合的抑郁症动物模型，被击败的动物糖皮质激素和 ACTH 水平升高，免疫功能及对疾病的抵抗力下降，且有不同脑区的多巴胺、GABA、谷氨酸和 5-HT 结合受体逆转改变，但 Lister Hooded 品系大鼠的获取很难。

社交失败模型是一种社会性应激，它模拟人类在正常交往中遇到挫折并孤立无助的情景，通过引起动物成员之间的社会冲突产生应激，在大鼠中由一个侵略雄性所引起的社交失败是一种自然应激因子，该种应激能引起分子、生理及行为变化，这种变化有时会很持久，包括自发及探索活动减少，侵略行为及性行为减少，服从行为及焦虑增加；同时相关文献报道显示，社交失败应激对奖赏系统产生影响，从而引起动物兴趣下降及快感缺失，这恰恰与抑郁症的核心症状相似。

2 间接刺激法

此类造模方法并非直接对实验动物进行负性躯体刺激如足底电击、束缚、禁食禁水或冷刺激产生应激，而是以另一批动物为依托，实验者对其施加各种电击等刺激，同时将应激 D-gal 组动物与直接应激动物置于同一环境中，以此诱发动物的心理应激反应。该类方法在一定程度上降低了模型的躯体应激成分，是一种较为理想的情绪应激动物模型，但其所诱发的情绪成分复杂，尚不够明确。

2.1 旁观电击法

Katsura 等设计的旁观电击小鼠方案作为小鼠的心理应激模型。被电击的小鼠（电击电流为 2mA，周期 5s，间歇 55s）产生惊叫、惊跳，甚至便失禁；实验应激组小鼠不受电击，而是旁观电击小鼠遭受电击的过程，通过视觉、听觉等而产生心理应激。但在我们的实验中发现，在实验的后期有些动物在电击鼠惊叫惊跳时身体转向另一侧，毫无反应，这与动物在此过程中心理上产生的适应性有关；同时，有的实验动物为了逃避足底电击,会爬到箱壁和顶部；动物的排泄物可能会导致电流减小或消失等, 我们试着通过增加电流的强度和延长电击时间来克服这些问题。

2.2 间接电击法

课题组前期的实验提出一种新的情绪诱发方法——间接电击激怒法，实验过程中人为地用电极触碰攻击鼠胸腹部，攻击鼠受电击后被激惹，对应激组大鼠发起攻击，双方互相撕咬、对峙，产生愤怒心理和行为。该法的优点在于刺激点在攻击鼠前部，攻击鼠误以为是其对面的实验鼠挑衅，遂攻击实验鼠，很容易进入对峙、打斗状态，诱发的愤怒情绪较为理想，很大程度上减少了躯体应激成分。

3 直接刺激法

直接刺激法的种类较多，是目前情绪应激动物模型最常用的方法，此类方法的特点是实验者将动物置于一种不可避免的应激环境，给予一种或多种刺激，如足底电击、束缚等，模型制作过程相对简单易操作，对实验条件的要求较低，更容易实现；但不可避免地存在躯体应激，若合理控制则较为成功。

3.1 足底电击、束缚等

很多文献以足底电击结合声音或光照作为应激条件，结果显示: 应激对照组与心理应激组受到的躯体刺激相同, 但后者无法根据光信号预见电刺激, 因此较前者更紧张, 心理应激程度更高。国内新近研究采用光电结合应激方法对糖尿病大鼠进行应激。结果显示糖尿病大鼠血糖明显升高， 光电结合应激抑制了大鼠的反应，并对糖尿病大鼠的行为、血糖产生了影响。束缚是一种纯粹的挫折应激，短时间的束缚应激可成功制作动物的焦虑模型，我们的实验中发现，随着束缚应激时程的增长，动物更多地表现出嗜睡、兴趣降低等抑郁样行为。但不同的束缚方式所引起的引起的躯体应激差异大。贺立娟等

运用慢性束缚应激结合孤养法建立肝气郁结证大鼠模型，研究发现,给予大鼠慢性束缚 21d 后，应激 D-gal 组 ACTH、CORT 水平升高，具有显著差异，柴胡疏肝散给药干预后可降低其水平，与用药前结果有显著性差异，该结果提示了此模型的中医病理机制与肝失疏泄有关。此外,噪音刺激、强迫游泳、冷热刺激等也可引发不可逃避性应激模型。

3.2 慢性不可预知性心理应激

近几年来国内外研究多采用多重复合应激法诱发动物的情绪反应，慢性不可预见性心理应激方法诱导动物的抑郁等复合负性情绪行为，此种应激模型中应激因子多样化且不可预测，能避免单一刺激所引起的适应性，可应用于慢性心理应激的神经生物学和行为心理学研究。它包括一系列不可预知的低强度应激, 如束缚、强迫游泳、禁食禁水、摇晃等,从病因学的角度模拟了抑郁症的环境诱因, 以旷场行为反应以及动物的糖水消耗量作为观测指标, 经过特异性及可信性评价,被认为是经典的慢性抑郁模型。徐志伟等研究发现逍遥散可通过下调慢性不可预知性心理应激损伤大鼠下丘脑室旁核区 CRH mRNA 表达而部分恢复慢性应激大鼠 HPA 轴负反馈功能，此结果提示此动物模型的预测效度较优。国外新近研究显示，慢性不可预知性心理应激上调多巴胺 D2 受体的表达，下调前额皮质的蛋白激酶 A,转录因子 cAMP 反应原件结合蛋白(CREB)，p-CREB ，cAMP 和蛋白激酶 A 水平下降，这与临床上抑郁患者的发现一致，这些初步提示多巴胺系统功能失调在应激相关的抑郁症等精神障碍疾病中起到核心作用。Ian Mahar 等将抑郁症和抗抑郁药物作用的血清素和神经性假设联系起来，发现慢性不可预知性应激显著地减弱了 5-HT 神经递质和 5-HT1A 自受体的敏感性，并且通过减少神经再生减轻海马对 HPA 轴的抑制，使应激轴过度活跃恶化。

4 基于条件反射的造模方法

4.1 惩罚性饮水

惩罚性饮水模型是将动物的饮水行为和不确定的电击结合起来，动物如果想满足饮水的需要就可能会受到电击的创伤，由此造成动物在饮水和避免电击之间的趋避冲突，产生焦虑反应。这种造模方法是从动物的本能需要出发，当动物的本能遭到威胁时，它们在心理上产生趋避反应冲突，诱发焦虑情绪。此种动物模型有较好的预测效度，是研究抗焦虑药物药理学机制的良好模型。我们在实际实验中发现，在实施这种造模方法前，必须禁水足够时间，同时要将大鼠置于电击箱中适应 4-5 小时，才能达到理想效果；我们还发现由于不同性别甚至不同动物个体在饮水需要方面的差异，它们所遭受的电击程度不一，这样造成个体所诱发的焦虑程度不一。这与 Ana M. Basso的研究结果一致，他们发现当与雄性大鼠同等体重匹配时，雌性大鼠受到更少的惩罚反应，更少的饮水摄入量，雌性大鼠比雄性大鼠对足底电击有更低的疼痛阈值，不同的抗焦虑药物在两种性别中显示出的抗焦虑样作用有较大差异。Carla Pisu 等研究显示，喹硫平对 C57BL6/N 饮水冲突模型大鼠显示出一种抗焦虑作用，5HT1A 拮抗剂WAY100635 消除。这些提示 5HT 系统在焦虑情感障碍模型中的重要作用。

4.2 空瓶应激

空瓶应激法是以不确定性空瓶饮水刺激作为应激源，训练动物在特定的时间段饮水，当动物感受到缺水应激之后，只给予动物一个没有水的空瓶, 动物吸吮空瓶而得不到水,从而产生挫折感，进而诱发动物的情绪反应。大量研究表明应激刺激的不可预测性是一个重要的影响因素。林文娟等研究发现不同时程的空瓶应激激活 HPA 轴和 SNS 轴(肾上腺素、去甲肾上腺素和皮质酮水平升高)的程度不同, 这可能与持续的慢性应激后 SNS反应出现了一定程度的适应性相关。欧阳俊彦等采用不确定性空瓶应激制作焦虑大鼠模型，发现 GABA 与焦虑大鼠额叶皮质的 NOS 及 NO 均呈剂量-效应关系，提示 GABA 可能通过调节焦虑大鼠额叶皮质中的一氧化氮水平发挥抗焦虑作用。

5 问题与展望

1872 年达尔文发表了《人类和动物的表情》一书，详细描述了多种动物以及人类的多种表情，生动地阐述了表情的进化过程。他从系统发生的观点对动物行为进行了比较研究，揭示出不同种的动物在行为模式上的相似性。也就是说，高等动物的行为成分和功能特征，也能在较低等动物身上找到。基于这个假设，情绪应激动物模型尝试在实验动物上复制人类精神障碍疾病的特征，此模型相关的生理和行为变化需符合特定情绪状态（表面效度）、疾病的病因学（结构效度）、以及药理学治疗反应（预测效度）。但情绪应激的发生是一个复杂的过程，应激反应因应激原种类、动物种属、性别、生理状态、周龄、应激状态、应激持续时间的不同, 这在一定程度上解释了各种情绪应激所导致的结果不一致性，但存在着一个基本的趋势：交感-肾上腺髓质和下丘脑-垂体-肾上腺皮质是应激反应的重要环节, 而血清儿茶酚胺和糖皮质激素水平的上升被视为应激反应的标志。应激所引起的个体反应是由神经-内分泌-免疫等系统网络共同作用的，究竟哪些系统在情绪应激发生过程中发挥关键作用，在应激的哪一进程起作用，这些尚有待进一步证实。

另外认知在应激发生和发展过程中起了很重要的中介作用，不同认知水平及性格特质的个体产生的应激反应不同，而且应激的病理生理改变涉及多个脑区功能的异常，考察动物的基线认知水平，并将其加入到情绪应激动物模型的考虑因素中，会使情绪应激动物模型更加接近人类情绪障碍疾病的发生机制，例如在在实验之前，采用水迷宫筛选认知水平接近的动物参与造模。

因此，发展有效、客观的情绪应激动物模型，优化实验设计、指标选择，系统全面地认识指标的变化，将会对进一步明确情绪应激过程的各个生理反应，深入分析情绪的心理学发生机制，以及今后探讨人类情绪障碍疾病的起因和发病机制有重要的指导意义。