条件性恐惧相关实验之胞二磷胆碱对氯胺酮麻醉致幼期大鼠长期认知功能损害的影响

内容

胞二磷胆碱对氯胺酮麻醉致幼期大鼠长期认知功能损害的影响

摘要: 目的: 探讨胞二磷胆碱对氯胺酮麻醉致幼期大鼠长期认知功能损害的治疗作用。方法: 54 只雄性PND7 大鼠幼鼠根据出生时间和处理方式分成 9 组: ①14 d 对照组( C14d组) 、14 d 氯胺酮组( K14d组) 、14 d 异氟烷 + 胞二磷胆碱组( K + C14d组) ; ②30 d 对照组( C30d组) 、30 d 氯胺酮组( K30d组) 、30 d 氯胺酮 + 胞二磷胆碱组( K + C30d组) ; ③60 d 对照组( C60d组) 、60 d 氯胺酮组( K60d组) 、60 d 氯胺酮 + 胞二磷胆碱组( K + C60d组) 。K14d组、K30d组、K60d组、K + C14d组、K + C30d组和 K + C60d组均在生后第 7 天、第9 天、第11 天、第13 天腹腔注射氯胺酮 70mg/kg，C14d组、C30d组和 C60d组在出生 7 d 后，腹腔注射生理盐水( 0． 5 ml，1 次/d，连续 7d) 。K + C14d组、K + C30d组、K + C60d组大鼠在腹腔注射氯胺酮后当天腹腔注射胞二磷胆碱500 mg/kg( 0． 5ml，1 次 / d，连续 7 d) 。大鼠分别在出生后 14d、30 d 和 60 d 进行条件恐惧实验测试认知功能。结果: 条件恐惧实验结果: 条件关联和条件暗示测试中，在出生后第 14 天，K14d组和 K + C14d组两组间的恐惧凝滞时间差异无统计学意义( P ＞0．05) ，但均短于 C14 d 组大鼠( P ＜0． 05) ; 在出生后第 30 天，K30d组短于 C30d组和 K+ C30d( P ＜0． 05) ，C30d组与 K + C30d组差异无统计学意义( P ＞0． 05) ; 在出生后第 60 天，K60d组短于 C60d组和K + C60d( P ＜0． 05) ，C60d组与 K + C60d组差异无统计学意义( P ＞0． 05) 。结论: 多次氯胺酮( 70 mg/kg) 腹腔注射麻醉可引起幼期大鼠长期的学习记忆能力损害; 胞二磷胆碱腹腔注射可抑制氯胺酮麻醉对幼期大鼠学习记忆能力的损害。

关键词: 氯胺酮; 学习记忆; 胞二磷胆碱; 认知功能障碍

氯胺酮是临床上( 尤其婴幼儿麻醉) 常用的全身麻醉药。虽然氯胺酮在大脑缺血等脑损害中有明显的抗损伤保护作用，但最近研究提示氯胺酮麻醉可以诱导处于脑发育期的大鼠脑神经元凋亡以及成年期后学习记忆改变。这提示幼期( 出生后早期或胎儿期) 经历麻醉对大脑学习能力的发育是一个危险因素。目前，对麻醉诱致的认知功能损害尚无有效的防治办法。胞二磷胆碱是细胞膜磷脂生物合成所需的中间物，基本结构包含胞苷和胆碱两部分。有研究提示，胞二磷胆碱可通过多途径抑制神经元凋亡，促进受损害的神经元修复。但胞二磷胆碱应用于治疗麻醉所致的神经损伤及认知功能损害少有报道。本研究拟通过应用氯胺酮麻醉出生后 7 d( postnatal days 7，PND7) 的大鼠幼鼠，观察氯胺酮麻醉对大鼠幼鼠认知功能的影响及腹腔注射胞二磷胆碱对氯胺酮麻醉所致的认知功能损害的治疗作用。

1 材料和方法

1． 1 动物和分组 54 只雄性 PND7 大鼠幼鼠分组( 共 9 组，每组 6 只) : ①14 d 对照组( C14d组) 、14 d 氯胺酮组( K14d组) 、14 d 氯胺酮 + 胞二磷胆碱组( K +C14d组) 。若同窝内雄性幼鼠 ＜ 3 只，该窝大鼠不纳入实验; 若同窝内雄性幼鼠≥3 只，1 只分至 C14d组、1 只分至 K14d组、1 只分至 K + C14d组; 若同窝内雄性幼鼠≥6 只，2 只分至 C14d组、2 只分至 K14d组、2 只分至 K +C14d组，以此类推分组。②30 d 对照组( C30d组) 、30 d氯胺酮组( K30d组) 、30 d 氯胺酮 + 胞二磷胆碱组( K +C30d组) ; ③60 d 对照组( C60d组) 、60 d 氯胺酮组( K60d组) 、60 d 氯胺酮 + 胞二磷胆碱组( K + C60d组) 。②、③分组办法同①。

1． 2 麻醉处理和药物注射 C14d组、C30d组和 C60d组，K14d组、K30d组、K60d组、K + C14d组、K + C30d组和 K + C60d组均在生后第 7 天、第 9 天、第 11 天、第 13 天腹腔注射氯胺酮 70 mg/kg( 0． 5 ml) 。K + C14d组、K + C30d组、K + C60d组大鼠在腹腔注射氯胺酮后当天腹腔注射胞二磷胆碱 500 mg/kg( 0． 5 ml，1 次/d，连续 7 d) ，其余所有大鼠均腹腔注射生理盐水 0． 5 ml( 1 次/d，连续 7d) 。麻醉期间将大鼠置于棉垫上，棉垫底部垫有电加热毯，调节并控制受试动物体温为38 ～39 ℃。麻醉复苏后剪耳标记并放回母笼饲养，分别在出生后14 d、30d 和 60 d 进行学习和记忆能力测试。在饲养过程中若同窝配对 3 只中任一大鼠死亡，配对中另 2 只亦剔出该实验，另择符合条件动物加入补充。

1． 3 条件恐惧实验 采用条件性恐惧实验系统( XＲ-XC404 型，上海欣软信息科技有限公司) 进行测试。测试分两天进行: 第 1 天，在 3 min 的适应探索期后给予 3 次声音( 2 000 Hz，90 dB，30 s) + 电流刺激( 1mA，2 s; 电流刺激在声音的最后 2 s 开始，与声音同时结束) ，3 次声音间隔为 1 min; 第 2 天进行条件关联实验( contextual fear conditioning，context) 和条件暗示实验( cued fear conditioning，cue) 。在 context 实验中，大鼠置于一个与第 1 天实验相同的场景中，无声音和电流刺激，录像 8 min; 在 cue 实验中，大鼠置于一个与第1 天实验不同环境的方盒中，在 3 min 的适应探索期后给予 3 次声音( 2 000 Hz，90 dB，30 s，无电流刺激) ，3次声音间隔为 1 min，录像 8 min。图像分析软件自动计算统计 context 和 cue 实验中大鼠的凝滞时间及所占时间百分比。

1． 4 统计学处理 应用 SPSS 15． 0 统计软件分析数据，定量资料用均数 ± 标准差( x－± s) 表示。采用单因素方差分析进行比较。P ＜ 0． 05 为差异有统计学意义。

2 结果

2． 1 条件关联测试结果 在出生后第 14 天，K14d组和 K + C14d组恐惧凝滞时间差异无统计学意义( P ＞0． 05) ，但均短于 C14d组大鼠( P ＜ 0． 05) ; 在出生后第30 天，K30d组短于 C30d组和 K + C30d组( P ＜0． 05) ，K30d组与 K + C30d组差异无统计学意义( P ＞0． 05) ; 在出生后第 60 天，K60d组短于 C60d组和 K + C60d组 ( P ＜0． 05) ，K60d组与 K + C60d组差异无统计学意义( P ＞0． 05) 。见表 1。

2． 2 条件暗示测试结果 在出生后第 14 天，K14d组和 K + C14d组两组间的恐惧凝滞时间差异无统计学意义( P ＞0． 05) ，但均短于 C14d组大鼠( P ＜ 0． 05) ; 在出生后第 30 天，K30d组短于 C30d组和 K + C30d组( P ＜0． 05) ，K30d组与 K + C30d组差异无统计学意义( P ＞0． 05) ; 在出生后第 60 天，K60d组短于 C60d组和 K + C60d组( P ＜0． 05) ，K60d组与 K + C60d组差异无统计学意义( P ＞0． 05) 。见表 2。

3 讨论

条件恐惧实验系统又名场景恐惧系统，是检测啮齿类动物对环境相关条件性恐惧的学习记忆能力的实验，是评价大鼠学习记忆能力常用方法之一。大鼠在恐惧时会表现出特有的行为凝滞状态( Freezing，动物特有的、静止不动的防御姿势) 。条件恐惧实验分环境联系( 条件关联，context) 实验和声音信号实验( 条件暗示，cue) 两部分。Context 实验中的凝滞时间反映大鼠海马依赖的学习记忆能力，cue 实验中的凝滞时间反映大鼠非海马依赖的学习记忆能力。测试中凝滞时间 延 长 为 促 进 记 忆，凝 滞 时 间 缩 短 为 记 忆损害。

大鼠大脑发育的高峰期主要是出生后 2 周内( 相当于人类的 3 岁以内) ，此高峰期也是神经元突触形成建立的关键期。因此在此关键期内，大脑的发育状况将直接影响成年期后的大脑功能的高级功能。有研究表明，氯胺酮麻醉可能对 PND 大鼠海马神经元有促进凋亡的作用，并影响其学习记忆能力，这种影响还可能与麻醉时间有关。因此，本研究选择处于大脑发育期的 PND7 大鼠作为研究对象，对其进行氯胺酮腹腔注射麻醉。有研究表明，低于 50 mg/kg 剂量、重复少于 3 次的腹腔氯胺酮注射麻醉对幼鼠长期学习记忆能力无明显损害。实验结果提示 70 mg/kg 氯胺酮麻醉对海马依赖和非海马依赖的学习记忆能力均有明显损害作用; 而且氯胺酮麻醉对 PND7 大鼠学习记忆能力损害比较持久( 可致出生后 60 d 或更久) 。

突触是神经元信息传递的结构基础，中枢神经元以突触的形式形成神经元网络对学习和记忆能力的发育极为重要。学习记忆功能与海马神经元的数量之间存在着依赖关系。有研究表明，氯胺酮麻醉能够影响新生大鼠的突触发育，并且影响其学习记忆功能。

胞二磷胆碱是常用的中枢神经保护剂。有研究表明，胞二磷胆碱对大鼠脑缺血损伤后的认知功能损害有明显的治疗作用。本研究结果显示，腹腔氯胺酮注射麻醉 PND7 大鼠期间连续 7 d 应用 500 mg/kg胞二磷胆碱腹腔注射，至出生后 30 d 可使大鼠学习记忆能力恢复至正常水平，提示胞二磷胆碱可以明显抑制氯胺酮麻醉对 PND7 大鼠学习记忆能力损害作用。

综上所述，多次氯胺酮( 70 mg/kg) 腹腔注射麻醉对幼期大鼠的学习记忆能力损害能持续至成年( 出生后 60 d 或更久) ; 胞二磷胆碱腹腔注射可抑制氯胺酮麻醉对幼期大鼠学习记忆能力的损害。