内藏乾坤的细胞实验常用缓冲液！一文讲全选择、总结与区分

PB磷酸缓冲液（phosphate buffer solution，PB）和PBS磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline），两者名字接近，但是不是同一种缓冲液，在成分上是有所差别的。

PB缓冲液通常由磷酸二氢钠（NaH2PO4）和磷酸氢二钠(Na2HPO4)配制而成（当然NaH2PO4和Na2HPO4也可以用水合物来配制，例如Na2HPO4.7H2O，配制时根据分子量换算过来即可）。

PB缓冲液的缓冲 pH 值范围非常广泛，可配制各种 pH 值的酸性、碱性和中性缓冲液。中性缓冲液用等浓度的 NaH2PO4 和 Na2HPO4 按照不同比例进行混合，可以配制成不同pH的缓冲液，通常在pH5.7-8.0之间使用。

另外PB缓冲液也有人使用磷酸钾缓冲液（即K2HPO4和KH2PO4)，其配制方法和缓冲液能力与磷酸钠缓冲液相同。

PBS缓冲液

下面这个表格为常用的1X PBS缓冲液即10mM PBS的成分表：

表1：1X PBS缓冲液配方

从表格中我们可以看到，PBS缓冲液具有与PB缓冲液相同的缓冲对：H2PO4-和HPO42-，与PB缓冲液不同的是添加了lv化钠和氯化钾去增加盐离子浓度。PBS缓冲液通常配制成pH7.2-7.4去使用。

对完整的、具有活性的物质不能保证其在最适条件下参与生物反应，PBS是最佳之选。它具有盐平衡、可调整的适宜pH缓冲作用。相比，蒸馏水不具有盐平衡作用，可以破坏生物蛋白的结构及生物特性；生理盐水不具有调整pH的作用。

另外一部分文献将该PBS缓冲液写成D-PBS（Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline）缓冲液，特意强调是不含钙、镁离子的配方。大部分D-PBS与表格中PBS缓冲液的配方成分一致。但也有部分厂家生产的D-PBS与PBS在成分的含量上有少量区别，D-PBS的KH2PO4与Na2HPO4的添加量略小于PBS。D-PBS主要用于胚胎学方面的研究，可作为胚胎、组织、细胞的漂洗液、冻存液和培养液。

应用上的区别：

PB缓冲溶液在化学反应、合成反应等化学领域中有广泛应用，部分在抗体制剂中也有应用。但如果用PB缓冲液冲洗细胞，会导致低渗吸水，甚至细胞胀破。所以要用于电泳或与细胞有关的缓冲体系时，则要用PBS缓冲液，相比PB缓冲液，除了可以维持一定的pH环境，还可以起到调节渗透压的作用。

PBST缓冲液与TPBS缓冲液主要是PBS缓冲液中加入了不同的非离子表面活性剂，以增加其水溶性。

PBS缓冲液中加入了非离子表面活性剂Tween-20,简称为PBST。PBS缓冲液中加入了非离子表面活性剂TritonX-100,简称为TPBS。两者均含有相同的PBS缓冲液。

PBST常用于免疫组化和原位杂交，酶联免疫等实验中。用作ELISA清洗液，亦可用于清洗Western Blot实验中PVDF膜或NC膜。在Western Blot洗液里的Tween-20（吐温20）是和BSA一样，对抗原抗体蛋白提供保护作用，同时因为是表面活性剂，可以减少抗体对抗原的非特异性作用，用于洗脱未结合的抗体，减少非特异性结合。

TPBS缓冲液中TritonX-100作用原理是能溶解细胞多种膜的脂质，包括细胞膜、细胞核膜、细胞器膜等，基于该原理使用TritonX-100对细胞进行处理，能使需要的抗体和大分子结构的物质进入胞浆和细胞核。例如流式检测细胞周期，需要染核蛋白时，细胞先固定，然后根据细胞情况进行透膜，即用0.1%-1%TritonX-100 PBS （即TPBS缓冲液）处理5-30分钟，具体的浓度和作用时间需要根据不同的细胞还有实验条件来优化。

TBST缓冲液中含有Tris-Base(C4H11NO3)，HCl， NaCl，Tween20这4种物质。Tris-Base(C4H11NO3)和HCl组成缓冲对，维持缓冲液的pH恒定。TBST缓冲液通常是配制成pH7.5去使用。是做Western Blot中常用的一种洗膜缓冲液。Western Blot实验中，为了防止曝光图背景太高，在孵育时，混有Tween 的TBST 能洗掉PVDF膜上非特异性吸附的蛋白质。Tween是一种离子表面活性剂，有复性抗原作用，可提高抗体特异性结合。

而PBST缓冲液中含有KH2PO4，Na2HPO4，KCl，NaCl，Tween20这5种物质，相比TBST缓冲液除了缓冲对不一样，还多了KCl，通常是配制成pH7.4去使用。也是用在ELISA，Western Blot实验中作为洗膜缓冲液使用。

TBST的pH值随温度变化大一点，而PBST由于盐浓度较高容易有沉淀。若稀释抗体后需要反复使用的话建议使用TBST溶解。

TBST和PBST两种缓冲液作为洗膜缓冲液使用时，两种洗液用起来没有什么区别，都是提供一个缓冲的pH值环境，加上Tween20有助于蛋白的洗脱。

Hank's溶液全称是Hank's Balanced Salt Solution---Hank's平衡盐溶液，简称HBSS.主要用于配制培养液，稀释剂和细胞清洗液，而不能单独作为细胞组织培养液。

D-Hank's溶液：Dulbecco's Hanks Balanced Salt Solution(D-Hanks),without Ca2+ Mg2+，通常该溶液瓶子上也都会注明不含钙离子，镁离子的。可用于细胞解离前清洗螯合剂，也常用于配制胰酶溶液（钙镁离子会抑制胰蛋白酶活性）。

因此从成分上来说，Hank's与D-Hank's的一个主要区别在于后者不含有钙和镁离子。那么Hank's溶液主要由什么组成呢？见下表

表2:1X Hank's溶液配方

从表2我们也可以看到，Hank's溶液的配方与PBS溶液的配方都含有相似的磷酸二氢钾，磷酸氢二钠，氯hua钠与氯hua钾，只是含量有所不同，Hank's溶液中磷酸盐含量要低一些，因为该溶液还有1个碳酸氢钠可以起到pH调节的作用。同时，该缓冲液添加了葡萄糖可以提供简单营养。

需要注意的是有的缓冲液厂家将Hank's溶液与D-Hank's溶液这2种缓冲液都当作是HBSS在销售，仅在缓冲液下方标注是否含钙镁离子，因此我们购买的时候就需要自己去区分了。另外还有部分厂家的Hank's溶液中添加有氯化镁。

EBSS（Earle's Balanced Salt Solution），也称为Earle's平衡盐溶液。EBSS主要成分为葡萄糖，NaHCO3，NaCl，KCl和Na2HPO4。

HBSS（见表2）与EBSS的成分相似，成分含量有所不同。其中HBSS的NaHCO3含量为0.35g/L，其缓冲能力较弱，一般用空气平衡，即利用空气中的CO2使溶液pH值平衡。而EBSS含有高浓度的NaHCO3（2.2g/L），其缓冲能力较强，溶液pH值需在5%的CO2培养箱中才能达到平衡。两者都是多数培养基的基础溶液，主要区别是缓冲能力不同。

EBSS专为CO2环境中的细胞短期维持而设计，具有维持渗透压、保持pH稳定、提供简单营养等作用，可用于体外实验中组织块、器官或细胞的漂洗、细胞或组织的运输、细胞培养用试剂的配制以及作为细胞计数的稀释液，也可用于诱导细胞自噬等。如果希望在CO2培养箱中保存组织，需要用EBSS。如果仅仅是清洗将要在细胞培养基中储存的组织，用HBSS液就可以了。

另外EBSS和HBSS都可以选择含或不含钙镁离子及酚红的溶液。酚红的添加主要是指示溶液的酸碱度变化。培养细胞，尤其是哺乳类细胞时，不加酚红。由于酚红干扰检测，一般在做流式细胞检测时，使用无酚红产品。钙镁离子会抑制胰蛋白酶的活性，与螯合剂螯合。含有钙镁离子的缓冲液通常用于作输送介质、试剂的制备；不含钙镁离子的缓冲液，通常用于细胞清洗。因此使用时应根据实验的需要进行选择。

值得提醒的是含有葡萄糖和碳酸氢钠（NaHCO3）的溶液不能进行高压灭菌，高压灭菌会发生反应引起变性。如果是自己配制的话，过滤灭菌即可，如果是直接订购现成的，要注意无菌分装。