未知代谢物鉴定
代谢组学一般根据以下四个维度对代谢物鉴定的可信度进行划分：可靠的鉴定得到的化合物（1级），通过假定注释得到的化合物（2级），通过假定注释对化合物类别进行鉴定（3级）和未知化合物（4级）。1级鉴定需要将目标代谢物的两个或多个正交特性（如保留时间、m/z和碎片质谱）与在相同分析条件下观察到的真实化学标准品的相同特性进行比较。推定（第2级或第3级）注释基本上仅依赖于一个或两个特性，且通常基于对不同实验室收集的以及不同分析方法获得的数据的比较，而不是在相同分析条件下与真正的化学标准品的直接比较。
未知代谢物指可以反复检测到的但其化学身份尚未确定的小分子。这些化合物虽然尚未被鉴定和分类，但在代谢组学实验中仍可根据光谱数据进行区分和定量。在LC-MS实验中，一个未知化合物将由唯一的保留时间、一个或多个质量或一个特定的初级离子碎片模式定义。在NMR实验中，一个未知化合物将由化学位移的模式定义。未知物可能代表先前没有被识别的小分子，例如代谢的次级产物或罕见的外源性物质，或者它们可能由已建立的途径构成分子但无法分配到现有的NMR参考谱库或MS碎裂模式。
未知化合物的鉴定非常耗时且成本高昂，通常需要进行制备规模的分离以进行NMR研究，或大量的化学合成才能使用MS/MS进行结构比较。因此，大多数报告都集中于检测具有可用的真实商业标准品或至少存在于代谢物数据库中的代谢物，即分类为1级，2级和3级的代谢物。由于许多代谢物固有的不稳定性和需求的缺乏，仅有数千种商业分析标准品可用。然而，这些标准品和数据库中存在的代谢物仅占内源性代谢物很小的一部分。因此，对于代谢组学研究来说，有效的方法来排序、研究和最终鉴定非特征代谢物是非常重要的。未知代谢物的成功鉴定将对生物标志物的发现和组学研究产生重大影响。
为了鉴定代谢组学样品中的未知化合物，应区分不同类别的代谢物，具有相同可分辨公称质量（nominal mass）的，具有相同可分辨公称质量但分子式和同位素质量不同的，相同可分辨公称质量和同位素质量但化学结构不同的，都应该对其进行区分。例如，亮氨酸和异亮氨酸是结构不同的异构体，但是可分辨公称质量和同位素质量相同。此外，由于单一代谢物可以在质谱仪中检测到不同的衍生物种，所以正确地将不同的衍生物种分配给母体代谢物也是很重要的。例如，在氨基酸分析中，三甲基硅烷化（TMS）与氨基酸发生化学衍生反应会生成含有1、2或3个TMS基团的氨基酸，这些氨基酸都应属于同一母体氨基酸。
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